分子生物学常用技术ppt精选课件.ppt

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1、分子生物学常用技术第十七章分子生物学常用技术凝胶电泳分子杂交聚合酶链反应(PCR)技术DNA的物理图谱DNA序列测定基因芯片.第一节凝胶电泳(gelelectrophoresis)电泳概念基本原理Qμ＝6πrημ:迁移率Q:电荷量r:粒子半径（分子量）η:介质粘度.电泳的用途分离鉴定纯度测定分子量凝胶电泳的种类琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳.一、琼脂糖凝胶电泳(agarosegelelectrophoresis)分离核酸原理操作要点应用范围.（一）分离核酸原理电荷效应分子筛效应分子构象.1.电荷效应核酸是两性电解质pH=3.5,正电荷pH=8.0~8.3,负电荷，正极..2.分子筛效应小

2、分子移动快，大分子移动慢.3.分子构象闭环超螺旋>线状DNA>开环DNA+-.（二）操作要点支持物凝胶浓度的选择DNA分子量标准电泳缓冲液样品制备电泳条件DNA电泳染色DNA片段的回收.1.支持物.商品化的琼脂糖.琼脂糖种类普通低熔点高纯高筛分熔点80~90℃<70℃80~90℃80~90℃机械强度中差高高分辨率中差中高.2.凝胶浓度的选择.凝胶的制备...3.DNAmarker.DNAmarker.DNA长度标准曲线.4.电泳缓冲液Tris-乙酸(TAE)pH8.0Tris-硼酸(TBE)pH8.0Tris-磷酸(TPE)pH8.0.5.样品制备上样缓冲液50%甘油/蔗糖0.5%溴酚蓝/

3、二甲苯青.点样.6.电泳条件潜水电泳恒压电泳低压:1~2V/cm中压:8~10V/cm高压电泳：>几十V/cm温度：15~25℃.潜水电泳.7.电泳染色溴乙锭(ethidiumbromide,EB)结构及染色原理染色方法加入凝胶液中电泳结束后染色.EB染色原理..紫外灯下显色.8.DNA片段的回收低熔点琼脂糖法透析袋电洗脱法(>5kb)DEAE-纤维素膜法(0.5~5kb).（三）应用范围DNA的分离、纯化和鉴定限制性酶切图谱分析重组体的分离、鉴定杂交分析PCR产物的分离鉴定.琼脂糖凝胶电泳.二、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE

4、)分离原理操作要点优点应用范围.（一）分离原理电荷效应分子筛效应.PAGE支持物单体－丙烯酰胺(Acr)交联剂－甲叉双丙烯酰胺(Bis)催化剂－过硫酸胺(AP)加速剂－N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED).聚丙烯酰胺凝胶.（二）操作要点凝胶的分类凝胶浓度的选择凝胶液的配制凝胶中DNA的检测DNA片段的回收.1.凝胶的分类非变性凝胶：dsDNA变性凝胶:ssDNA尿素甲酰胺SDS.2.凝胶浓度的选择..3.凝胶液的配制试剂(ml)制备浓度(%)3.55.08.0122030%Acr11.616.626.640.066.6ddH2O67.762.752.739.312.75XTBE2

5、0.020.020.020.020.010%AP0.70.70.70.70.7TEMED35ul/100ml.PAGE装置....电泳.4.凝胶中DNA的检测溴乙锭染色法银盐染色法甲醛还原放射自显影法Ag+－DNAAg（黑褐色）.5.DNA片段的回收压碎浸泡法<1kb纯度高，回收率低.（三）PAGE优点机械强度好、化学稳定性高分辨率高载样量大回收的DNA纯度高.（四）PAGE应用范围分离、纯化和鉴定RNA和小分子DNADNA序列分析PCR产物鉴定蛋白质的检测和分析.第二节分子杂交分子杂交的基本原理固相支持物探针几种常用杂交技术.一、分子杂交的基本原理核酸的变性和复性.分子杂交DNA-DNA

6、.DNA-RNA.杂交条件靶分子探针杂交袋杂交炉.杂交种类被检核酸种类和方法原位杂交斑点杂交Southern杂交Northern杂交Western杂交反应介质液相杂交固相杂交().二、固相支持物固相支持物的特性结合能力强不影响杂交反应结合牢固非特异性吸附少机械性能良好.固相支持物的种类硝酸纤维素滤膜(nitrocellulosefiltermembrane)尼龙膜(nylonmembrane).1.硝酸纤维素滤膜特点吸附ssDNA和RNA杂交信号本底低不足不适于重复杂交滤膜较脆不适于电转移印迹法对DNA小片段(<200bp)结合能力弱.2.尼龙膜特点结合能力强可反复杂交韧性强适于电转移印

7、迹法对DNA小片段(10bp)结合能力强不足杂交信号本底较高.分子生物学考试时间：2005.1.11(晚7:00-9:00)地点9教讲演厅(150人)9-2-1(50人)9-2-2(50人)9-3-1(50人)答疑：1.10(9:00-11:30;3:00-5:30)地点：逸夫楼3楼生化实验室.三、探针(probe)探针的概念探针的类型标记物的种类标记方法.1.探针的概念特异结合和检测靶分子的活性物质抗原－抗体配体－受体