Mir-150与转录因子c-Myb靶向结合控制B细胞的分化ppt课件.ppt

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1、Mir-150与转录因子c-Myb靶向结合控制B细胞的分化2110424何晓丹MiR-150是一种在成熟淋巴细胞中特异性表达的microRNA(miRNA)，但并不在其祖细胞中表达。MiR-150在体内与c-Myb靶向结合，影响淋巴细胞的发育和免疫响应。c-Myb是一种控制淋巴细胞发育多个步骤的转录控制因子。B细胞在老鼠和人体的发育和分化是复杂的过程，它从胎肝和具有增殖能力的祖细胞的骨髓开始，它们的抗原受体基因经历有序重排产生分化。B细胞成熟四阶段祖B细胞（proBcells）前B细胞（preBcells）未

2、成熟B细胞（immatureBcells）成熟B细胞（matureBcells）一、淋巴细胞发育过程中miR-150的阶段特异性表达为了研究miRNAs在淋巴细胞发育中的生物学功能，我们研究了miRNAs在淋巴细胞发育特定阶段行为中的特异性表达，通过将基因表达谱和Northernblot分析相结合，我们确定了符合这个标准的一些miRNA。MiR-150，一种在成熟和休眠的淋巴细胞中高度表达的miRNA，但不是在它们的祖细胞中。这种阶段特异性表达模式表明了miR-150可能在淋巴细胞发育或功能中发挥作用。二、M

3、iR-150靶向结合转录因子c-MybC-myb基因，淋巴细胞正常发育的一个重要的转录因子，是miR-150的首要靶向结合目标基因之一。C-Myb在淋巴细胞发育中的表达模式是与miR-150相辅相成的，因为c-Myb在淋巴祖细胞中高度表达，在成熟细胞中下调。三、miR-150的缺乏导致B1细胞增殖和增强体液免疫应答B细胞特异性缺失C-Myb基因将严重阻碍B细胞从祖B细胞（proBcells）向前B细胞（preBcells）转换以及其中一个成熟B细胞亚基的缺失，即所谓的B1细胞。如果miR-150在体内的确是与

4、c-Myb靶向结合，预测miR-150的不足将导致的表型与由于c-Myb的丢失所引起的表型相反，以及miR-150在祖B细胞的异位表达将阻碍B细胞发育。Cre-Loxp重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。Cre重组酶：Cre重组酶是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。LoxP序列：来源于P1噬菌体，是有两个13bp

5、反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下：5'-ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-3'3'-TATTGAAGCATAT-TACATACG-ATATGCTTCAATA-5'酶联免疫法（ELISA法）ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶

6、催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法（四）双位点一步法（五）捕获法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素的ELISA捕获法测IgM抗体血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。

7、（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。四、异位miR-150的表达损害淋巴细胞发育已经证明miR-150抑制体内c-Myb蛋白水平，和Mir150-/-小鼠表现出的表型与由于B细胞系中c-Myb的消融所引起的表型相反，

8、我们推断在B细胞前体中miR-150的异位表达将下调c-Myb蛋白水平和阻碍B细胞发育，这与B细胞特异性缺失c-myb基因引起的现象相似。五、C-Myb蛋白水平的微小变化有严重的功能性后果C-Myb蛋白水平减少30％-35％是否足以引起mir150转基因小鼠表型的剧烈变化？我们分析了杂合的c-Myb敲除小鼠以解决这个问题。这些结果表明，淋巴细胞的发育对于c-Myb蛋白水平的微小变化是极其敏感的，与m