实时荧光定量PCR原理与应用ppt课件.ppt

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1、东胜汪洋实时荧光定量PCR原理与应用基本原理实验体系的建立应用基本原理实验体系的建立应用基本原理电泳，EB染色基本原理实时荧光定量PCR常规PCR荧光实时分析每一次循环产物凝胶电泳分析终产物精确计算初始模板浓度，灵敏度高，检测单拷贝模板通过终产物定性分析模板浓度计算机自动纪录分析检测方法费时费力荧光曲线如何对初始模板定量荧光信号如何产生？lens基本原理两个概念：域值线－指数增长期内设定的一条平行于x轴的直线。在域值线上所有样品拷贝数相同，所需循环数不同。（域值线可机器自动选择，也可认为设置）C(t)值：

2、域值线上不同扩增曲线所对应的循环数ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04阈值线Ct值Ct值基本原理基本原理理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率XCt=X0(1+Ex)Ct=NlogX0=-log(1+Ex)*Ct+logN原理：初始模板量的对数值与C(T)值之间呈线性关系基本原理定量原理浓度的对数值与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数

3、就可计算出样品中所含的模板量基本原理基本原理实验体系的建立应用SYBRGreen1MolecularBeaconsTaqMan实验体系的建立-荧光化学试剂SYBRGreen15’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission实验体系的建立-SYBRGreenI5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission实验体系的建立-SYBRGreenI延伸结束，形成双链DNA，此时sybrgreen结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发是，会发射出荧光－－检测时机在延伸

4、结束时按照常规PCR方法配制反应体系，并加入SYBR染料程序1.95c5min2.95c20sec3.60c20sec4.72c20sec5.ReadPlate6.Goto2repeat397.72c5min8.4cforever9.End问题：PCR的不特异性产物；SYBRGreenI的非特异结合解决：熔链曲线分析，决定读板温度Meltingcurveanalysis实验体系的建立-SYBRGreenI熔链曲线分析逐步提高温度，读取荧光值，得到温度与荧光值的关系曲线温度荧光强度TmTm值：DNA解链一半

5、时的温度-dIdTTm实验体系的建立-SYBRGreenI决定读板温度Non-specificproductspecificproductspecificproduct实验体系的建立-SYBRGreenI熔链曲线分析1.94℃5min2.95℃10sec3.58℃30sec4.72℃20sec5.Plateread6.85℃1sec7.Plateread8.Gotostep2formore39times9.Performmeltingcurvefrom55.0℃to95.0℃,readevery0.2℃,

6、holdfor1sec优化的程序实验体系的建立-SYBRGreenI不同读板温度对实验结果的影响:72℃实验体系的建立-SYBRGreenI不同读板温度对实验结果的影响:85℃实验体系的建立-SYBRGreenI使用SYBRGreenI染料常规PCR体系SGI荧光定量PCR体系标准曲线如何制作PCR产物、质粒DNAOD260定量分子量计算拷贝数换算10倍系列稀释液实验体系的建立-SYBRGreenISYBRGreenI的稀释原液10倍稀释于DMSO，可长期储存使用前100倍稀释于纯水SYBRGreenI的

7、保存SYBRGreenI的原液十分稳定稀释后-20度可保存半年避光，避免反复冻融SYBRGreenI试剂盒Bio-RadFinnzymeQiagen等实验体系的建立-SYBRGreenI非特异性标记－SYBRGreenI的特点：优点：1、方便易用，成本较低2、除模板定量外，还可做溶解曲线，进一步验证定量结果的准确性程度。不足：特异性差，无法区分目的基因和杂带。如果PCR反应条件优化不好，容易产生较多杂带，影响定量结果的准确性。推荐：有梯度PCR仪优化实验条件，将使优化简单化，是SYBRGreenI标记法取

8、得好效果的重要条件。实验体系的建立-SYBRGreenITaqManRQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation实验体系的建立-Taqmanprobes使用TaqMan探针探针、引物的设计引物反应条件的优化加入探针进行预实验标准曲线的制作探针设计软件：Primerexpress、Beacondesigner实验体系的建立-TaqmanprobesGC含量30－80％5’端避免出现重复