发酵工程综合实验报告.docx

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1、《发酵工程综合实验》实验报告实验题目：蛋白酶产生菌的分离筛选与培养优化姓名学号院系专业生物技术年级13级任课教师2015年12月25日1实验目的1、学习从土壤样品中分离筛选蛋白酶产生菌的基本技术及测定蛋白酶活力的方法。2、掌握富集、平板稀释涂布法、平板划线培养法分离筛选蛋白酶产生菌的基本原理。3、掌握蛋白酶产生菌培养优化的原理与方法。4、熟悉用正交实验优化发酵培养基的方法。5、了解蛋白酶产生菌生产的实际意义。2实验原理蛋白酶产生菌的分离筛选：在土壤中有许多细菌和霉菌能产生蛋白酶，本实验将土壤样品悬液稀释进行划线分离得到可能含有目的菌株的

2、菌落，将其接种到酪蛋白平板上进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基进行培养，测定蛋白酶的活力，最终筛选到产蛋白酶的目的菌。蛋白酶活力测定原理：蛋白质或多肽在275nm波段处具有最大吸收值，利用蛋白酶同酪蛋白底物反应前后在三氯乙酸中可溶物的紫外吸收增值，可表示蛋白酶活力高低。蛋白酶产生菌的培养优化：本实验采用正交实验进行目的菌株的培养优化方案。正交实验是利用已经设计好的表格“正交表”来安排、实验并进行数据分析的一种方法。数据处理可采用直观分析法（极差分析法），通过对每一因素的平均极差来分析问题。3实验材

3、料3.1实验试剂葡萄糖、乳糖、蔗糖、蛋白胨、尿素、酪氨酸、酵母膏、碳酸钠、琼脂粉、牛肉膏、硫酸铵、硫氨酸、三氯乙酸、氯化钙、氯化钠、MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、3.2实验设备250ml三角瓶、150ml三角瓶、10ml移液管、1ml吸头、酒精灯、大烧杯、试管、量筒、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、分光光度计、电炉、水浴锅、离心机、漏斗、滤纸、培养皿。4实验步骤（一）配制所需培养基及灭菌1、按照以下配方配制所需的培养基（1）、牛肉膏蛋白胨培养基（分离培养基）200mL：牛肉膏0.5g、蛋白胨1g、NaC

4、l0.5g、琼脂1.5g、水100ml、pH7.2。（2）、酪蛋白固体培养基(筛选培养基）200mL：葡萄糖1g、酪蛋白3g、NaCl0.5g、琼脂2.0g、水100ml、pH7.0～7.2。（3）、酪蛋白液体培养基（产酶培养基）200mL：葡萄糖2g、蛋白胨2g、NaCl0.5g、水100ml，pH7.0～7.2。（4）、将配制好的培养基放入高压蒸汽灭菌锅中经20min高压灭菌。（二）分离与筛选1、分离（1）、采集土壤样品10g，用无菌水制备1:10土壤悬液100ml。（2）、取8支试管，用无菌移液管吸取1mL菌悬液1mL，放入装有9

5、mL无菌水的试管中吹吸数次混匀后即为10-1。再用无菌移液管吸取10-1的菌悬液1mL放入装有9mL无菌水的试管中，吹吸数次混匀即为l0-2稀释液。如此重复，可依次制成10-3--10-8的稀释度并编号1--6。（3）、涂布平板：取编号1--6试管菌悬液0.1--0.2ml分别滴在牛肉膏蛋白胨培养基（分离培养基)表面的中央位置，用涂布棒涂布均匀并对应编号1--6。37℃恒温培养36h并记录生长情况。2、筛选（1）、对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔在酪蛋白固体培养基（筛选培养基）上进行划线接种，根据酪

6、蛋白平板上的水解圈作初筛。（2）、选择水解圈直径与菌落直径比值大的菌，接入酪蛋白液体培养基(产酶培养基），37℃，140rpm摇床上震荡培养12h，将发酵液于5000rpm离心10min，取其上清液为酶液进行蛋白酶活力的测定。（三）蛋白酶产生菌酶活力测定1、蛋白质或多肽在275nm波段处具有最大吸收值，利用蛋白酶同酪蛋白底物反应前后在三氯乙酸中可溶物的紫外吸收增值，可表示蛋白酶活力高低。2、绘制标准曲线：项目0123456100ug/ml酪氨酸溶液（ml)00.10.20.30.40.50.6酪氨酸的浓度（ug/ml）010203040

7、5060PH8.0磷酸缓冲液（ml)65.95.85.75.65.55.40.4mol/l三氯乙酸（ml)5555555测定步骤：取7支试管按上表加入试剂并混匀，40℃保温20分钟，用滤纸过滤，滤液用紫外分光光度计测定275nm的吸光值。将1--6号管所测得的光密度（OD）减去0号管所测得的光密度为净OD值。以此酪氨酸OD275数据绘制标准曲线。3、测定蛋白酶活步骤：取5mL用pH8.0磷酸缓冲液制备的0.6%酪蛋白溶液于试管中，40℃预热2min后加入1:20以pH8.0磷酸缓冲液稀释的酶液1mL，40℃反应10min后，加5mL0.

8、4mol/L三氯乙酸以终止反应，并沉淀残余底物，40℃保温20min使沉淀完全，用漏斗加滤纸过滤，滤液用紫外分光光度计测定275nm的吸光值。另外以先加三氯乙酸使酶失活、后加酪蛋白的试管，按上述同样步骤测定