基因工程实验报告(程庆佳,生物技术,20091070004).doc

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1、大肠杆菌核糖核苷酸HII基因的克隆及其检测（基因工程实验报告）程庆佳（云南大学，生命科学学院，生物技术，）（班级：周二下午实验班;组号:第八组;老师：赖建华；同组员：顾聚）摘要：此次实验的目的是对大肠杆菌核糖核苷酸HII基因的克隆及其检测，其中的关键步骤包括了大肠杆菌基因DNA的提取，PCR扩增，DNA体外重组，感受态细胞的制备，重组DNA的转化，重组转化的检测等多种具有紧密连接性的实验，使学生可以掌握一套具有连贯性的实验过程，帮助学生塑造连贯试验的观念，从而得到更好地成长与进步。关键词：提取、扩增、重组、感受态细胞、转化、检测正文：此次实验的最终目

2、的是要使学生连贯性的掌握本学期的实验，所以要求我们要熟悉每个实验的原理过程，以及实验结果的准确分析，只有这样才能保证实验最终结果的准确性，才能真正地掌握此次实验。1、大肠杆菌基因组DNA的提取原理：DNA是一个环形的大分子DNA,真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内。不同种属的生物，以及不同形式的细胞（如菌类、培养细胞、植物组织，动物组织）基因组提取的方法是不同的，但其基本原则是类似的，即既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消

3、化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（

4、0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。简要步骤：（1）、菌种活化：将菌落接种于LB培养基中，37度培养过夜（2）、取1ml菌液转入1.5ml离心管中，5000rpm离心1分钟，去上清。（3）、加入500ulTE，50ul10%SDS，5ul蛋白酶K，混匀，55度，保温20min（4）、加入50ul，5MNacl混匀，再加入50ulCTAB提取液，混匀，65度

5、，20min（5）、去蛋白：300ul的酚和氯仿，轻轻混匀，10000rpm，2min（6）、上清转入另一个干净的1.5ml离心管，加入等体积氯仿异戊醇，轻轻混匀，10000rpm，2min，上清转入干净的1.5ml离心管中（7）、加入1/10体积的醋酸钠，2倍体积的无水乙醇轻轻旋转小试管，可见絮状沉淀，即为染色体丝，10000qpm，3min收集沉淀（8）、弃上清，沉淀用500ul75%乙醇洗涤两次（每次10000rpm离心1min）（9）、室温下稍干，加适量（约50ul）RTE溶解，37度30min（10）、电泳观察结果12如图所示，1号为本组实

6、验结果。对比maker,第一条带为正常大肠杆菌基因组，中间可以看见模糊的条带，可能为断裂的基因组片段，下面最亮的为RNA。出现断裂的基因组可能是由于操作过于剧烈。本组电泳带还比较清晰整齐，其他组不整齐的带可能是电泳技术问题。RNA含量很大，所以显示比较清晰。在电泳过程中应注意的是胶浓度要与DNA分子量呈线性关系，所以胶浓度对于实验结果检测的成败有重要的意义。另外，在实验过程中应避免用力，以此来保障DNA样品结构的完整性与稳定性。1、PCR扩增目的基因核糖核苷酸酶HII基因原理：聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是一

7、种体外DNA扩增技术。该技术能在几小时的实验操作中，将人为选定的一段DNA扩增几百万倍，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等优点。PCR的工作原理类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片断和与其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、退火及延伸三步反应的多次循环，使特定的DNA片断在数量上呈指数增加。PCR扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。反应体系由模板DNA、一对引物、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组成。PC

8、R反应循环的第一步为加热变性，使双链模板DNA变性为单链；第二步为复性，每个引物将与互补的DNA序列杂交；第