固定化酶和细胞原理.ppt

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1、第八章固定化酶反应原理与技术酶催化剂的优点：专一性强，反应条件温和，反应速度较快。弱点：溶液酶在反应后，分离困难，重复利用困难；溶液酶稳定性差，易失活。1969出现了固定化酶技术。固定化酶就是把原来游离的水溶性酶，设法限制或固定于某一局部的空间或者固定于载体上。概述生物催化剂细胞酶非生长生长可溶固定化悬浮固定化连续间歇吸附包埋交联化学连续材料膜固定酶液凝胶吸附化学连接物固定化再循环系统凝胶吸附连续半连续分批间歇连续活塞模式搅拌连续反应器间歇连续活塞模式搅拌连续反应器图8-1生物催化剂作用方式示意固定化酶的发展史什么是固定

2、化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术二．固定化酶的优缺点多次使用可以装塔连续反应优点：纯化简单提高产物质量应用范围广缺点：首次投入成本高大分子底物较困难固定化酶的性质及其影响因素一．影响固定化酶性质的因素二．固定化后酶性质的变化三．评价固定化酶的指标一．影响固定化酶性质的因素1．酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。2．载体的影响（1）分配效应（2）空间障碍效应（3）扩散限制效应3.固定化方法的影响二．固定化后酶性质的变化1．固定化对酶活性的影响：酶活性下降，

3、反应速度下降2．固定化对酶稳定性的影响（1）操作稳定性提高（2）贮存稳定性比游离酶大多数提高。(3)对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。(4)对分解酶的稳定性提高。（5）对变性剂的耐受力升高2．固定化后酶稳定性提高的原因：a.固定化后酶分子与载体多点连接。b.酶活力的释放是缓慢的。c.抑制自降解，提高了酶稳定性。3．pH的变化PH对酶活性的影响：（1）改变酶的空间构象（2）影响酶的催化基团的解离（3）影响酶的结合基团的解离（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。1）载体带负电荷，pH向碱性方向移

4、动。微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。载体带正电荷，pH向酸性方向移动。（2）产物性质对pH的影响催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高；反之则低4．最适温度变化一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。5．底物特异性变化作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶特异性往往会变化。6．米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化由于分配效应：ρ=[Si]微环境/[S]宏观环境Km'=Km/ρ(表观米氏常数)（1）载体与底物带相同电荷，S

5、i]<[S],ρ<1,Km’>Km固定化酶降低了酶的亲和力。（2）载体与底物电荷相反，静电作用，[Si]>[S]，则ρ>1,Km'

6、的指标。连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）3.4.或称偶联效率，活力保留百分数。5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力四固定化酶的活力测定方法介绍1.振荡测定法：称取一定量的固定化酶加入一定量的底物溶液，一边振荡或搅拌，一边进行催化反应取出一定量的反应液进行酶活力测定。2.酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中让底物溶液以一定的流速流过酶柱收集流出的反应液测定其中产物的生成量或底物的消耗量3.连续测定法利用连续分光光度

7、法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。固定化酶的性质及其影响因素提要影响固定化酶性质的因素固定化酶的性质评价固定化酶的指标酶本身的变化载体的影响固定化对酶活性的影响固定化对酶稳定性的影响最适pH的变化最适温度变化底物特异性与游离酶不同米氏常数Km的变化评价指标活力测定方法固定化酶的制备一．一般方法及特点二．酶的固定化方法一．一般方法及特点关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进。1．四大类方法：吸附法（包括电吸附法）结合法（无机多孔材料）交联法（双功能试剂）包埋法（微

8、胶囊法）各类固定化方法的特点比较:比较项目吸附法结合法交联法包埋法物理吸附.共价键结合离子键结合制备难易易难易较难较难固定化程度弱强中等强强活力回收率较高低高中等高载体再生可能不可能可能不可能不可能费用低高低中等低底物专一性不变可变不变可变不变适用性酶源多较广广泛较广小分子底物、药用酶2．选择方法依据：（1）酶的性质