液相色谱实验.docx

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1、反相高效液相色谱中流动相极性强度对分离的影响一、实验目的：1.了解反相色谱中流动相强度对容量因子的影响。2.了解反相色谱中流动相强度对相对保留值的影响。3.了解反相色谱中流动相强度对分离度的影响4.掌握选择流动相条件的筛选原则。二、实验原理：分离度（R）即两谱带的分离程度，表征色谱的分离质量。其基本公式为：R=n4（r-1r）（kk+1）分离度是由三个主要因素决定：理论塔板数（n），分离因子（r），容量因子（k’），要想改变分离度，则需设法改变以上三个因素。当色谱柱选定后，理论塔板数n值已定，可看做

2、常数，当流动相的种类选定后，分离因子值也可视作定值，要想改变分离度R，可通过改变容量因子k’值来实现，常用的办法是通过改变流动相组分的配比来实现。本实验中，使用不同的流动相配比，分离一对同系物——甲苯和苯的混合物，可以清晰地看到流动相强度的改变对相关色谱分离性能指标的影响。计算公式如下：R=2tR2-tR1W1+W2k'=t'Rtmn=16tRWb2neff=16t’RWb2式中，tR1，tR2为相邻两色谱峰的保留时间，t’R为调整保留时间，tm为死时间，W1、W2为相邻两色谱峰的峰宽。以硫脲为死时

3、间标记物。三、仪器与试剂：1.高效液相色谱仪，紫外检测器，ODS色谱柱（4.6mm*150mm），微量注射器（平头），超声波脱气机，抽滤装置一套。2.试剂：甲醇（色谱纯）、苯、甲苯和硫脲，以上试剂均为分析纯，试验用水为三次石英蒸馏水。3.以甲醇为溶剂，配制苯、甲苯和硫脲的混合液，浓度分别为1500ppm(v/v)、300ppm(v/v)和15ppm(w/v)。四、实验步骤：1.流动相前处理：将实验使用的流动相进行过滤和脱气处理2.开机：依次打开高压泵、检测器、工作站。调整色谱条件如下：流动相体积流速

4、1mL/min，检测器检测波长210nm，柱温：室温。1.选择流动相配比为：甲醇：水=90:10，待系统平衡后，进样20μL，出峰结束后，记录样品各组分峰的保留时间及峰底宽度。2.依次更换流动相配比，甲醇：水=85:15、80:20、60:40，重复第三步的操作，在不同的流动相配比下对样品进行分离。5．用甲醇清洗色谱系统至基线稳定（10-20min）后，关机。五、数据处理：流动相组成（甲醇:水）原始数据处理结果tmt'R1t'R1W1W2k'1k'2neff1neff2r21R90:1085:158

5、0:2060:40六、结果讨论：从上表的数据处理结果可得到哪些结论？解释其原因。七、注意事项：1.流动相在使用前均要过滤和脱气。2.取样时，微量注射器应反复清洗，注射器不应存有气泡。八、思考题：1.简述在反相色谱法中，流动相配比的改变对流动相强度的影响。2.利用色谱相关知识推定色谱峰与被分离组分的对应关系。3.解释流动相使用前必须过滤和脱气的原因。4.该实验中为什么选择硫脲作为死时间标记物？用丙酮可否？5.将本实验中获得的苯和甲苯的平均有效柱效（换算为塔板数/米）与气相色谱实验中获得的苯和甲苯的平均

6、有效柱效（塔板数/米）相比较。通过比较可得到哪些结论？解释其原因。6.选择最佳流动相组成的原则是什么？讨论用改变流动相强度来改变R的局限性。