液相色谱实验

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1、一、目的与要求1、掌握高效液相色谱法测定中成药中橙皮苷含量的原理及操作方法。。2、熟悉高效液相色谱仪的使用及注意事项。二、基本原理利用十八烷基键合相色谱柱，43%甲醇为流动相，UV270nm为检测波长，外标一点法测定中成药中橙皮苷的含量。三、仪器与试药1、Waters515型高效液相色谱仪，2487紫外检测器2、超声提取器3、溶剂过滤器4、对照品：橙皮苷5、甲醇：色谱纯；水：娃哈哈纯净水6、0.45μm微孔滤膜英文名称：Hesperidine，VitaminP别名：橙皮甙、桔皮甙、陈皮甙、柑果甙、二氢黄酮甙、橙皮苷、二氢黄酮苷分子式：C28H34

2、O15；分子量：610.6成分来源：柑橘类水果外观：白色或淡黄色针粉末熔点：257-260℃溶解性：难溶于水；几乎不溶于丙酮、苯、氯仿，微溶于甲醇、热冰醋酸；可溶于甲酰胺、二甲酰胺，易溶于稀碱溶液来源。药理作用：维持渗透压，增强毛细血管韧性，缩短出血时间，降低胆固醇等作用，在临床上用于心血管系统疾病的辅助治疗，可培植多种防止动脉硬化和心肌梗塞的药物，是成药“脉通”的主要原料之一。橙皮苷实验五HPLC法测定中成药中橙皮苷的含量----外标一点法1、色谱条件1）色谱柱：HypersilODS2(250mm×4.6mm,5μm)2）泵：Waters51

3、5pump3）流动相：MeOH-H2O(43:57)4）柱温：室温5）流速：1mL/min6）检测器：Waters2487DualAbsorbanceDetector7）检测波长：270nm8）进样量：10μL9）理论塔板数：按橙皮苷计算不低于3000四、实验步骤2、实验用溶液的配制1）橙皮苷对照品溶液的制备精密称取橙皮苷对照品1.6mg，置100mL量瓶中，加95%MeOH至刻度，摇匀，制成0.016mg/mL的溶液，作为对照品溶液。（C橙=0.016mg/mL）2）供试品溶液的制备：精密称取中药复方0.3g置100mL量瓶中，加入50mL9

4、5%MeOH，加塞称重，超声提取15分钟后，放置室温，再称重，并用甲醇补足减少的量，摇匀。用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。3、测定分别吸取95%MeOH以及上述样品各10μL，注入高效液相色谱仪，进行测定，记录橙皮苷的峰面积。四、实验步骤保留时间（分钟）峰面积橙皮苷对照品供试品中橙皮苷4、外标一点法计算100g复方中含有多少克橙皮苷（保留两位有效数字）四、实验步骤A供/A标=C供/C标样品：0.3g50mL含量(%)=C供×Dm×100%对照品：C标=0.016mg/mL五、注意事项1、泵耐压：4000PSI2、安装柱方向3

5、、不要开空泵4、实验条件以及参数的选择1）色谱柱（固定相）：首选；其次2）流动相：流动相系统（互溶、澄清、首选）、过滤、脱气、使用缓冲盐溶液、含盐酸盐的流动相（×，腐蚀不锈钢）3）pH：弱酸弱碱的分离；大极性酸、碱的分离4）测定波长的选择：max5）流速：6）温度：5、样品的处理6、进样时取样量保存7、色谱柱的保存1、HPLC应用于中药制剂定量分析最常用的定量方法是什么？为什么？2、HPLC法测定中药制剂中某成分含量时，如何确定选用外标一点法或外标二点法？3、简述GC、HPLC建立中药制剂有效成分含量测定方法时系统适用性试验的各项参数及具体指标

6、。六、思考题用HPLC法测定中药制剂中成分含量时，要做哪些必要的实验才能建立一个完整的分析方法?1、提取条件的选定2、分离纯化方法的考察3、测定条件的选择4、线性关系考察5、检测限6、定量限7、精密度实验8、重复性实验9、稳定性实验10、测定方法的准确度实验（加样回收率实验）11、专属性实验（空白实验，阴性对照法）12、样品测定