现代分析技术大连水产学院ppt课件.ppt

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1、第四章生物免疫分析技术免疫学方法在食品分析中正得到越来越广泛的运用，其中酶联免疫吸附法（ELISA）已经在食品工业中广泛应用，它能够用于测定人们希望含有的物质，以及不希望含有的物质。例如现在人们所关注的食品安全性问题中一些物质的检测：杀虫剂、药物残留物、激素、生长素、微生物毒素、真菌毒素或肠毒素、天然毒素，以及一些添加剂。免疫分析法具备有效的灵敏度、特异性、快速和低成本的优点；可对大量的样品进行常规分析；能够用于样品的定性筛选，也能够对样品进行定量测定以确定样品中待测组分的含量。4.1免疫的原理Ag+AbAg－Ab特异性、灵敏性在Ag，Ab反应中，

2、用容易示踪的化学物质标记一种反应物，以了解反应是否发生，发生部位，以及发生的程度（即对未知成分的样品进行定性、定位及定量分析）。4.2酶联免疫法免疫酶技术：把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来。它具有免疫荧光试验和放射免疫试验的优点，并克服上述两种方法的缺点。酶标记试剂制备容易、稳定、有效期长，免疫酶技术的敏感性接近放射免疫试验，可直接肉眼观察也可借助简单的仪器作定量测定，所得结果比较客观。酶免疫测定或免疫酶技术是指酶标记抗体或酶标记抗体进行的抗原抗体反应。它主要包括两个方面：免疫过氧化物酶法：以过氧化物酶作为标记，与抗原或抗体

3、结合，然后根据酶与其底物间所产生的不溶性颜色产物，借助于光学或电子显微镜观察细胞及亚细胞水平的抗原或抗体。酶联免疫吸附法：根据可溶性抗原或抗体与不溶性固相载体结合后，还保留其免疫活性，结合了作为标记的酶催化作用。ELISA的基本原理和方法ELISA的种类和变化ELISA的特点ELISA的应用实例ELISA4.2.1基本原理它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底

4、物（显色剂）测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量成正比，因此可借助于颜色反应的深浅来定量抗体或抗原。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。其方法简单，方便迅速，特异性强。4.2.2酶及其底物酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELI

5、SA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物，将得到不同的颜色反应。酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐橘红色黄色棕色兰色蓝绿色492460449425642碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色红色400500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色深蓝色405420β-Ｄ-半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷

6、(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光黄色360,4504204.2.3ELISA的种类和变化（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法（四）双位点一步法（五）捕获法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素的ELISA（一）双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原步骤：A将已知抗体吸附于载体上，温育后清洗；B加入待检标本溶液，使溶液中的抗原与吸附的抗体结合，温育后清洗；C加入酶标记特异性抗体，温育后清洗；D加入酶作用底物，产生显色反应，颜色的改变与所加的待检标本溶液中的抗原量成正比。间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗

7、体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。（二）间接法步骤：A将已知可溶性抗原吸附于载体（聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠），经温育后清洗；B加入待检稀释血清，若血清中有相应特异性抗体存在则与吸附的抗原结合，温育后清洗；C加入酶标记的抗球蛋白抗体，此时酶标记抗抗体与吸附的抗原抗体复合物结合，温育后清洗；D加入酶作用底物（或称基质），酶分解底物并显色，用光电比色计测定底物显色深浅，即可推知抗体量。（三）竞争法此法可用于检测小分子抗原。步骤：A将已知抗体吸附于固相载体表面，温育后清洗；B将可能含抗原的待检溶液和酶标记的已知抗原溶液以适当比例混合，加入已包

8、被的载体孔中，温育后清洗；C加入酶作用的底物，产生显色反应。色深表示结合的酶标记抗原多，而待检溶液中未标记的抗原量少；反之