人工染色体载体解析ppt课件.ppt

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1、基因工程GeneticEngineering10/8/20211常规载体在工作时都是在不影响质粒和噬菌体复制功能的基础上装载外源DNA片段的，同时保持质粒和噬菌体的基本特性。这样一来，这些载体所装载的容量就受到限制。人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb的DNA片段，此时质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。10/8/20212将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体

2、，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。10/8/20213利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体载体。其装载外源DNA片段的容量就可以与染色体的大小媲美。10/8/20214第四章　人工染色体载体10/8/20215利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体载体。人工染色体载体:模拟染色体的复制方式，因此都能装载大片段的DNA片段。10/8/20216目前常用的人造染色体载体包括：细菌人工染色体载体（BAC）酵母人工染色体载体（YAC）黏粒载体（co

3、smid）P1人工染色体载体（PAC）10/8/20217λ-噬菌体载体和M13-噬菌体载体的装载量最大分别为25kb和1.5kb，装载量无法满足现代基因工程的需要。在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒。由于cos质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。构建黏粒和噬菌粒的原因和思路10/8/20218

4、pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalI一类人工构建的含有λ-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。1978年Collins和Hohn发明构建1.8kb的λ-DNA片段+pBR322片段第一节　黏粒（cosmid）载体10/8/20219第一节　黏粒（cosmid）载体黏粒克隆载体（柯斯质粒载体）实际上是质粒的衍生物，是由英文“cossite-carryingplasmid”缩写而成的，其原意是指带cos位点的质粒。pHC796400bpTcrlfragm

5、entcosoriAprPstIBamHISalI10/8/202110考斯质粒（cosmid）=质粒+cos序列。pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalI它是用正常的质粒同λ噬菌体的cos位点构成。cos序列是l噬菌体DNA中将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。10/8/202111黏粒它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段DNA，装载范围为31–45，克隆的最大DNA片段可达45kb。①质粒复制起点（colE1）象质粒一样转化和增殖。②抗性标记Am

6、pr。③cos位点。有的粘粒载体含有2个cos位点。pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalI一、黏粒的结构特征和用途10/8/202112一、黏粒的结构特征和用途能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制；重组操作简便，筛选容易；装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围；不能体内包装，不裂解受体细胞。10/8/202113二、构建cosmid克隆载体的策略根据λ噬菌体克隆载体和质粒克隆载体两者的这些性质，取长去短，

7、设计由质粒和含有cos位点的这种λDNA片段组装成一类新的克隆载体，即cosmid克隆载体。10/8/202114由λDNA片段和pBR322质粒DNA联合组成的。cosmid载体----pHC7910/8/202115pBR322质粒(p43)10/8/202116用λ噬菌体基因组的cro—rⅡ的BglⅡ限制片段，取代pBR322质粒DNA的位于1459～1666bp之间的Sau3A片段，产生出具有BglⅡ单切割位点的重组体分子。然后通过这个位点，将带有cos序列、长度为1.78kb的λDNA之BglⅡ片段插入

8、进去，于是得到了pHC79柯斯质粒.10/8/202117λDNA片段除了cos位点之外，在其两侧还具有与噬菌体包装有关的DNA短序列；质粒DNA部分则是一个完整的复制子。克隆能力为31～45kb，而且能够被包装成为具有感染性能的噬菌体颗粒。10/8/202118三、cosmid克隆载体的特征①构建的cosmid克隆载体是一种环形双链DNA分子，—般在5--7kb。②co