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时间:2017-12-14
《细胞凋亡小体和梯状dna的观察》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、细胞凋亡小体和梯状DNA的观察细胞死亡作为生物体的一种常见现象,一般可分为两种类型:细胞坏死(necrosis)和细胞程序性死亡(programmedcelldeath,PCD)。后者也称细胞凋亡(apoptosis)。细胞坏死是细胞在遭受极度刺激时引起的细胞死亡,以细胞质膜的破裂为特征,造成内含物的炎性泄露,是一种非正常死亡。细胞凋亡是细胞的一种“主动性”死亡行为,由基因控制,表现为细胞染色质凝集并边缘化、细胞浓缩、凋亡小体产生及DNA片段化等。由于片段化而形成的DNALadder被认为是细胞凋亡的典型特征。细胞程序性死亡被分为两
2、类:受体介导的细胞程序性死亡和线粒体介导的细胞程序性死亡。本实验主要涉及到线粒体介导的凋亡途径。线粒体可以进行氧化磷酸化并产生ATP,同时它还可以诱导产生PCD发生的物质-细胞色素C(cytC)的泄漏。线粒体膜上存在Bax组成的孔道。Bcl-2等抑制它的开放,从而抑制PCD因子的释放和阻止PCD的发生。而Bad等促进Bax开放,从而导致Apaf:apoptosisproteaseactivatingfactor活化,使cytC的释放,促进CytC,Apaf-1,caspase-9复合物的形成,使得细胞处于细胞凋亡的执行阶段。凋亡的标
3、准特征之一,是基因组DNA断裂为180-200bp的多条寡核小体片段。此现象可用常规琼脂糖凝胶电泳检测,是凋亡的特征。DNA梯状序列最后可在紫外灯下显示,人们可以照像记录它的电泳行为。根据DNA的电泳行为,人们就可以判断出细胞死亡的类型。凋亡细胞形成明显的梯状DNA,坏死细胞为不清晰弥散状DNA,而活细胞DNA在琼脂糖凝胶的顶部,是一个没有受到切割的高分子量条带。一、实验原理Cytc是电子传递链的重要组成部分,定位于线粒体内,是真核细胞内不可缺少的重要因子。但当他溢出线粒体后就会诱导细胞凋亡。在本实验中,对洋葱内表皮、烟草悬浮细胞或
4、人口腔内皮细胞等加入Cytc或其他诱导物,观察诱发产生的凋亡细胞。用改良苯酚品红染色观察凋亡细胞核发生染色质凝集(condensation)、趋边化(margination)、DNA裂解(fragmentation)产生凋亡小体等形态学上的变化,用琼脂糖凝胶DNA电泳检测细胞凋亡后形成的DNALadder。二、材料、试剂和仪器1.材料采用的烟草悬浮细胞株系、洋葱内表皮和人口腔内皮细胞。2.试剂的配制:1)烟草悬浮细胞的基本培养基(见附录5)2)100μmol/lCytc的水溶液3)170nmol/L或230nmol/L的CaCl24
5、)改良苯酚品红染色先配母液A和B。 母液A称取3g碱性品红,溶于100mL的70%酒精中(此液可长期保存)。 母液B:取母液A10mL,加入90mL的5%石碳酸水溶液(2周内使用)。 苯酚品红染色液:取母液B45mL,加入6mL冰乙酸和6mL37%的甲醛。 改良苯酚品红染色:苯酚品红染色液2-10mL,加入90-98mL45%的醋酸和1.8g山梨醇。 此染液初配好时,颜色较浅,放置二周后,染色能力显著增强,在室温下不产生沉淀而较稳定。5)1%的琼脂糖凝胶6)2ⅹCT
6、ABbuffer:2%(w/v)CTAB、100mmol/LTris-HCl(pH8.0)、20mmol/LEDTA、1.4mol/LNaCl、1%PVP、7)氯仿:异戊醇(24:1)三、实验程序1.取样1)直接撕取洋葱内表皮和刮取人口腔上皮细胞2)烟草悬浮细胞的培养烟草(Nicotianatabacum)悬浮细胞在改良的MS液体培养基(内含MS基本培养基,KH2PO4200mg/L,2,4-D1ml/L,Gly1.8mg/L,VB10.6mg/L)中继代培养,每7天继代一次,培养基pH5.8,110rpm/min摇床振荡,25℃悬
7、浮培养。2.细胞凋亡的诱导1)Cytc处理:共做三组样品。试验组样品要先经Cytc处理,浓度为12.5μmol/L,如实验材料为人口腔上皮细胞,时间为1hr左右,如是洋葱内表皮或烟草悬浮细胞时,时间控制为48hr左右;正对照样品不需处理,为正常生长的细胞;负对照样品是将正常的细胞煮沸30min,使其坏死。在具体做实验时,也可以采用不同浓度的Cytc进行处理: (1)Cytc诱导人口腔上皮细胞的凋亡步骤: ①涂片; ②漂洗均参照细胞骨架实验的操作; ③处理:浸泡于三种不同浓度的CytC溶液中;
8、 ④分别于1hr后分时间段取出,用改良苯酚染液染色30min; ⑤镜检观察。 (2)细胞色素C诱导的洋葱内表皮细胞凋亡步骤: ①将洋葱内表皮切成1cm2的小块,浸泡于三种不同浓度的CytC溶液中;
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