拟南芥中一个与ANK6互作的蛋白功能的初步研究.pdf

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1、分类号——学校代码!Q5垒2密级——学号2QQ墨!垒Q2QQ窆鱼拟南芥中一个与ANK6互作的蛋白功能的初步研究PreliminaryStudiesontheFunctionofanANK6—·interactingProteininArabidopsis指导教师姓名、职称奎盔屋数拯塞盘邀拯湖南师范大学学位评定委员会办公室2011年4月摘要ANK6(ank删nrepeatprotein6)属于锚蛋白家族，包含三个ANK重复模体，作为接头蛋白介导蛋白与蛋白之间的相互作用。实验室的研究已发现，在拟南芥中，ANK6通过与转录因子SI

2、G5相互作用调控雌雄配子的识别从而影响了拟南芥的双受精的完成。筛选和鉴定线粒体中与ANK6相互作用的其他蛋白，对于阐明ANK6在精卵识别调控过程中的作用机制，具有重要的理论意义。应用酵母双杂、BiFC等生化、细胞学技术以及遗传学研究手段，对一个与ANK6互作的“新"基因的功能进行了初步的研究，结果如下：应用酵母双杂交的方法，以ANK6为“诱饵”筛选拟南芥的cDNA文库，获得与之相互作用的候选蛋白--Atl916870。序列比对等生物信息学分析显示该蛋白与人的hDAP3蛋白同源，命名为AtDAP3，在拟南芥中是一个单基因蛋白。

3、mAP3参与细胞线粒体内蛋白的合成，以及调控细胞程序性死亡，而AtDAP3的功能未知。为了鉴定ANK6与AtDAP3的相互作用，利用酵母双杂交及BiFC(双分子荧光互补)的方法，从体外和体内两个方面对其互作关系进行了检验，证实二者可以相互作用。通过GFP标签法构建转基因植株，应用激光共聚焦及线粒体特异染料Mitotracker染色将AtDAP3基因共定位在线粒体上；ANK6与AtDAP3的BiFC结果也显示它们在拟南芥叶肉细胞原生质体的一种点状细胞器中相互作用。这些结果表明在AtDAP3定位在细胞的线粒体内，这与hDAP3等

4、的定位一致。该结果也为ANK6与AtDAP3相I互作用提供位点上的可能性。利用GUS报告基因研究AtDAP3启动子的活性，构建转基因植株，发现该基因在植物的幼嫩组织如根尖、茎尖等部位强烈表达。又通过构建不同长度的启动子片段，找到核心启动子序列，通过软件分析发现其中包含了许多参与组织发育的特定顺势元件以及一些环境胁迫元件。构建AtDAP3过表达转基因植物，发现在甘露醇、高盐、ABA处理下，过表达拟南芥种子萌发要比野生型的早，且后期生长也较野生型快。总之，我们的研究表明AtDAP3与ANK6在拟南芥细胞线粒体内相互作用。这些研究

5、结果为以后更深入的研究AtDAP3的功能提供了有价值的参考。关键词：ANK6，AtDAP3，蛋白相互作用ⅡandidentifyproteinsthatintercatwithANK6inthemitochondriafortheunderstandingofANK6’Sfunctioninthedoublefertilization．byusingyeasttwo-hybrid，BiFCothercytological，orgeneticsapproaches，anANK6一interactingproteininArab

6、idops&，AtDAP3，WaSidentifedfunctionallystudiedpreliminarily．ByusingANK6aS‘'bait"，acDNAlibraryWaSscreenedseveralinteracting‘proteinswereidentifiedincludingAtl916870，ahomologueofaknownhumanproteinhDAP3(Death-associatedprotein3)，andWaSdesignatedAtDAP3．AtDAP3isaunigenei

7、nArabidops&itsfunctionisunkown．Toconfn'rntheinteractionbetweenANK6AtDAP3，weperformedyeasttwo—hybridbimolecularfluorescencecomplementation(BiFC)assays．BothresultsprovedthatAtDAP3interactedwithANK6．ⅡITodetermineitssubcellularlocation，anAtDAP3一GFPfusionwasconstructeda

8、ndtransformedintoArabidopsisplants．AtDAP3一GFPWaslocalizedinmitochondriabyusingconfocalmicroscopyandMitoTracker，amitochondrial—specificdye．Wealsoo