免疫组化实验步骤及配方.doc

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1、免疫组化步骤1.多聚甲醛灌流取材，多聚甲醛后固定，30%多聚糖溶液沉糖;2.冰冻切片（1d-14d脊髓>=20μm;14d-28d>=10μm;DRGd=10μm）3.0.01MPBS洗10min×3次;4.1NHCL暴露抗原30min；5.去离子水洗，0.01MPBST洗10min×3次；6.3%双氧水(0.01MPBS配制)洗10min，灭活内源性HRP；7.0.01MPBST洗10min×3次；8.5%-10%血清封闭30min（0.01MPBST配制）；9.一抗过夜，一抗用PBST稀释；10.0.01MPBS洗1

2、0min×3次，二抗3孵育小时；11.0.01MPBS洗10min×3次，HRP-亲和素3小时；12.0.01MPBS洗10min×3次，DAB显色12-18min。免疫组化常用试剂配制1.0.1MPB:14.5gNa2HPO4·12H2O500mLH2O1.5gNaH2PO4·2H2O2.0.1MPBS:500mL0.1MPB45gNaCl3.0.01MPBST:100mL0.01MPBS10滴TritonX-1004.INHCL:盐酸：水=1：105.4%多聚甲醛：13.6gKH2PO43.6gNaOH40g多聚甲醛

3、1000mLH2O注：1).需要60°C加热溶解，过滤使用；2).多聚甲醛每次比需要多称10g，以弥补后面过滤的损失；3).现将多聚甲醛溶于1000mL水中，然后一边加热搅拌一边缓慢加入多聚甲醛的助溶剂NaOH，待NaOH和多聚甲醛都完全溶解后再加入KH2PO4，溶后过滤备用。6.DAB液：以0..1MPB配制，DAB浓度0.05%，H2O2浓度0.03%。注：1).H2O2临用时再加；2).用DAB染后用0.01MPB洗。7.30%蔗糖：150g蔗糖500mL4%多聚甲醛注：可同时沉糖后固定。8.封闭液：10%山羊血清

4、（做免疫荧光时另加0.1%BSA）。