荧光原位杂交技术课件.ppt

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1、荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术第一节原位杂交技术简介第二节荧光原位杂交技术的应用第三节原位杂交操作步骤第四节影响杂交的因素第五节荧光原位杂交技术的新进展原位杂交技术简介insituhybridization原位杂交技术的基本原理是根据核酸分子碱基互补配对的原则，将有放射性或非放射性标记的外源核酸（探针）与经过变性后的单链DNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，再经一定的检测手段将待测核酸在染色体、细胞或组织上的位置显示出来的一项技术。该技术最早是PardueandGall(1969)和Johnetal.(1969)分别独立建立起来的。

2、当时使用的放射性标记探针，利用放射自显影检测一些高度重复序列DNA在染色体上的定位，此后原位杂交技术日益成为生物医学领域的一种十分重要的技术手段。尽管放射性标记探针灵敏度很高，能够检测小至几百个碱基对的DNA序列，但是由于同位素的安全问题、半衰期、信号统计等限制了此项技术的广泛应用，后来逐渐发展出了非放射性标记探针原位杂交技术。原位杂交操作步骤一、准备载玻片和固定材料二、染色体标本制备和预处理三、探针制备及标记四、染色体标本变性五、杂交六、杂交后洗脱七、免疫细胞化学检测八、荧光显微镜观察及显微摄影染色体标本制备预处理1、RNA酶处理1）每

3、张玻片加100μl100μg/mlRNaseA(in2xSSC)37℃处理1小时2）用2xSSC洗3×5min3）70%，80%，100%乙醇系列脱水，每级5分钟2、胃蛋白酶处理1）0.005-0.02%pepsin（10mMHCl）37℃处理10min2）1×PBS洗2×5min3）1×PBS，50mMMgCl2处理5min4）1×PBS，50mMMgCl2,1%甲醛固定10min5）PBS洗涤并脱水,气干非放射性标记法直接法荧光素（fluorescein）或其他荧光染料间接法地高辛（digoxigenin）生物素（biotin）1.随

4、机引物法2.缺口平移法3.PCR法4.寡核苷酸末端标记法5.直接在探针3’或5’端合成1.0.5ml离心管中加入1ug探针DNA,加水置体系为16ul2.沸水浴中变性10min,马上置于冰水中3.加入4ulDIG-HighPrime(5xbuffer;50%glycerol;1U/μlKlenowenzyme;5xrandomprimermix;1mMeachofdATP,dCTP,anddGTP;0.65mMdTTP;and0.35mMDIG-11-dUTP)4.混匀离心，置于37℃温育1小时~20小时5.65℃处理10min终止反应染

5、色体标本变性共变性杂交液加到标本上封片，置80℃烘箱中10分钟分别变性70%甲酰胺，2xSSC70℃处理2分钟70%，85%，100%冷乙醇系列脱水，空气干燥1.杂交液(50%去离子甲酰胺,2xSSC,10%硫酸葡聚糖,50mM磷酸钠;pH7)中加入标记的探针，每10ul杂交液含50ng探针2.探针95℃变性5分钟，置冰水中10分钟3.10ul杂交液加到标本上，盖盖玻片并封片4.湿盒中37℃杂交过夜杂交1.2xSSC,50%甲酰胺45℃洗3x5min2.2xSSC37℃洗2x5min3.TNTbuffer[100mMTris-HCl(pH

6、7.5),150mMNaCl,0.05%Tween20]37℃洗1x5min杂交后洗脱1.TNTbuffer冲洗2.TNBbuffer[100mMTris-HCl(pH7.5),150mMNaCl,0.5%blockingreagent]3.Anti-DIG-荧光素(2μg/ml,inTNB)37℃30min4.TNTbuffer冲洗3x5min5.乙醇系列脱水,气干6.DAPI染色10min7.加Vectashield封片,荧光显微镜下观察并照相免疫细胞化学检测影响杂交的因素一、影响杂交的主要因素温度、pH、单价阳离子浓度、甲酰胺二、其

7、他因素探针长度、探针浓度、硫酸葡聚糖、洗脱严谨度三、标准杂交条件FISH技术的应用基因定位染色体结构变异(异位、缺失、重复)研究染色体物理作图疾病及产前诊断外源基因检测多倍体起源进化研究分子核型研究染色体（质）空间结构研究荧光原位杂交技术新进展M-FISH，armFISH(42-colorM-FISH),SKYBAC-FISH,YAC-FISHFiber-FISHPRINS(PrimedinsituDNAsynthesis)引物原位DNA合成技术IS-PCR(insitupolymerasechainreaction)原位PCRGISH(

8、GenomeinsituHybridization)基因组原位杂交Immuno-FISH3D-FISHQ-FISH（Quantitative-FISH），Flow-FISHT-FISH（Tis