行业标准：DB37T 3802-2019 花生品种鉴定技术规程 SSR标记法.pdf

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1、ICS65.020B04DB37山东省地方标准DB37/T3802—2019花生品种鉴定技术规程SSR标记法Protocolforidentifyingpeanutvariety—SSRmarkermethod2019-12-24发布2020-01-24实施山东省市场监督管理局发布DB37/T3802—2019前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省花生研究所。本标准主要起草人：闫彩霞、单世华、赵小波、李春娟、

2、王娟、苑翠玲、孙全喜、宋秀霞。IDB37/T3802—2019花生品种鉴定技术规程SSR标记法1范围本标准规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeat，SSR）标记法进行花生（ArachishypogaeaL.）品种鉴定的术语与定义、仪器设备、试剂与溶液配制、引物信息、鉴定方法、数据读取与判定方法。本标准适用于花生品种的鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T

3、3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则NY/T2237植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南花生3术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1简单重复序列simplesequencerepeat，SSR由几个核苷酸（1～6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100～200）的串联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其多态性主要来源于串联数目的不同。3.2推荐引物recommendedprimer

4、根据最少引物区分最多品种的原则筛选出的一套SSR引物，具有条带清晰、多态性高、重复性好、均匀分布的特点，用于DNA分子数据的采集和品种鉴定。3.3参照品种referencevariety具有推荐SSR位点上不同等位变异的花生品种，用于辅助确定送检样品的等位变异扩增片段的大小，校正仪器设备的系统误差。4仪器设备1DB37/T3802—2019所用仪器设备见附录A。5试剂、溶液配制及引物信息5.1试剂及溶液配制试剂及溶液配制见附录B（除特殊说明外，所用试剂均为分析纯）。5.2引物信息推荐引物的相关信息见附录C。6鉴定方法6.1样

5、品准备6.1.1样品为花生种子及其他植物组织。种子样品的分样和保存，按照GB/T3543.2的规定执行。6.1.2每份样品中至少随机抽取10个个体，每个个体单独分析。如样品为种子，水培法种植，至第三片真叶长出后备用。参照品种（见附录D）各种植2粒，混合分析。6.2样品的DNA提取6.2.1DNA提取取花生幼嫩组织50mg，放入组织破碎仪中，液氮研磨。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取基因组DNA，室温风干，加入100μL1×TE（pH8.0）溶液溶解DNA。完全溶解后每管加入5μLRNAase，37℃温育1h，－20℃下

6、保存留用。6.2.2DNA浓度和质量检测利用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，GoldView染料进行染色。测定DNA溶液的OD260/OD280值，在1.8～2.0范围内最佳。测定其OD260的吸光度，以1个OD260值相当于50mg/LDNA浓度来计算DNA的浓度。稀释至工作浓度为30ng/μL，置于4℃下备用。6.3PCR扩增6.3.1参照品种的使用在进行PCR扩增和等位基因检测时，不同SSR引物的参照品种参见附录C。6.3.2反应体系总体系为10μL，包括4.5ng/μLDNA，0.8μmol/LF/R引物，1

7、×DreamTaqGreenPCRMasterMix，1.9μL蒸馏水，混匀。6.3.3反应程序95℃预变性3min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，进行35个循环；72℃延伸5min；4℃下保存备用。6.4PCR产物检测2DB37/T3802—20196.4.1玻璃板组装清洗玻璃板和样品梳，晾干。用无水乙醇擦拭凹板和平板各2遍，待玻璃板彻底干燥后，将1.0mm厚的塑料边条整齐摆放在平板两侧，盖上凹板，对齐，夹紧，用水平仪调平。6.4.2制胶根据凝胶的面积和数量，调整6%聚丙烯酰胺凝胶溶液的用量，分别加

8、入1‰的APS和1‰的TEMED，轻轻摇匀，防止产生气泡，迅速灌胶。待胶液充满玻璃板夹层，在上部凹面处轻轻插入样品梳平端，深度约0.8cm。室温下静置1h，使胶液聚合，如室温较低可适当延长聚合时间。6.4.3电泳准备将制好的胶板固定于垂直电泳槽上，凹板向内。上下槽中各加入1×TBE缓冲液，