冰城链霉属间接合转移体系的构建.doc

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1、科技创新实验论文冰城链霉菌属间接合转移体系的构建学生：邢月超、姚萌、白晶芝、丁秀云单位：生命科学学院指导教师：向文胜2012年9月23日冰城链霉菌属间接合转移体系的构建摘要：本次试验采用的冰城链霉菌是从土壤中分离筛选得到的一株新的吸水链霉菌菌株，它能代谢产生米尔贝霉素，本次试验对于冰城链霉菌-大肠杆菌属间接合转移体系的构建方法条件进行了初步的摸索和优化，对于后续基因的转移等相关实验内容奠定了基础，便于后续相关操作的进行。关键词：冰城链霉菌;大肠杆菌;属间接合;异源表达1.前言1.1冰城链霉菌简介冰城链霉菌

2、（Streptomycesbingchenggensis）是由向文胜实验室从中国哈尔滨土壤中分离筛选得到的一株新的吸水链霉菌菌株，并对该菌株进行了形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁化学成分及16SrDNA序列（DQ449953）等鉴定（Wang等，2009a；Xiang等，2007a），通过与其它菌株进行比较，鉴定其是一新种链霉菌。在高氏培养基表面冰城链霉菌生长紧密，随着时间的推移菌落颜色逐渐变深，有白色最终变成灰色。油镜下观察基丝分枝，无横隔，不断裂；气丝分枝较多，较基丝粗?；成熟的菌丝直径为0.

3、8-1.2um，孢子丝为3-8圈紧密螺旋。通过电镜观察孢子呈卵圆形，表面有明显的疣。冰城链霉菌的线性染色体长度11936683bp，菌内没有质粒存在，G+C含量为70.8%，这是迄今为止公布的较大的细菌基因组之一。染色体上分为三个区域：7.2Mb的核心区域，1.5Mb的左臂和3.2Mb的右臂。通过分析，其上有10023个预测的蛋白编码序列，其中6419个具有可知的或者潜在的功能。83%的基因分布在核心区域，许多与次级代谢有关的基因则分布在两臂上。初步数据分析，冰城链霉菌基因组上至少含有23个与聚酮化合物、

4、非核糖体多肽和萜生物合成有关的基因簇。其中的14个基因簇定位在染色体右臂，包括米尔贝霉素和冰城霉素；南昌霉素和其他5中?隐藏的基因簇位于染色体核心区域（Wang等，2010a）。冰城链霉菌的代谢产物具有杀虫活性，实验表明该链霉菌能够产生对叶蜡、蚜类等具有高效防治能力的抗生素（Xiang等，2007b；Wang等，2009b；Wang等，2010b；Xu等，2010）。该菌发酵液的结晶产物通过核磁共振和质谱的鉴定，含有米尔贝霉素、南昌霉素、冰城霉素A和冰城霉素B。其中包括具有较高商业价值的米尔贝霉素A3和A

5、4组分及10个新颖的米尔贝霉素类似物（高爱丽等，2007）。1983年米尔贝霉素A3和A4组份的混合物被用做杀螨剂，被美国环境局推荐为对环境友好的杀虫杀螨剂（王则等，2009）。1.2大肠杆菌-链霉菌属间接合转移Trien-Cuot等(1987)阐明了通过属间接合转移将质粒从大肠杆菌向一些革兰氏阳性菌转移的可行性，随后大肠杆菌-链霉菌属间接合转移的方法也得以建立[4]。由于很多链霉菌的原生质体转化系统难以建立，大肠杆菌-链霉菌属间接合转移技术得到了日益广泛的应用。用于大肠杆菌-链霉菌属间接合转移的质粒应该

6、携带以下元件:大肠杆菌质粒复制子、来自大肠杆菌IncP质粒RK2/RP4的转移起始位点oriT、能在大肠杆菌和链霉菌中进行筛选的抗生素抗性基因。接合转移的发生还需要一些反式作用因子的参与，因此要将携带目的基因的待转移质粒转化进能编码这些反式作用因子的大肠杆菌宿主中，这样，携带目的基因的待转移质粒就可以在反式作用因子的辅助下，从oriT开始以滚环复制的方式从大肠杆菌向链霉菌转移。大肠杆菌-链霉菌属间接合转移具有以下一些优点:首先，操作相对简便，不依赖于宿主菌原生质体的制备和再生技术；再者，接合转移过程中，质

7、粒以单链的形式进入宿主菌，基本避免了链霉菌宿主限制系统对外源DNA进入细胞造成的障碍；最后，接合转移实验中使用的载体可以在大肠杆菌中复制，因而前期的克隆构建操作也相应简便。1.3立题依据及意义本次试验采用的冰城链霉菌是从土壤中分离筛选得到的一株新的吸水链霉菌菌株，它能代谢产生米尔贝霉素。大肠杆菌-冰城链霉菌属间接合转移体系的构建对后续实验有很大帮助。将具有调控作用、与冰城链霉菌相关模块结构或功能类似的基因导入质粒中，通过属间接合转移的方法将质粒导入冰城链霉菌中，可以将冰城链霉菌中相关基因替换或改造，从而可

8、能产生具有新性状的化合物，或提高原有产物的产量。因此，探索大肠杆菌-冰城链霉菌属间接合转移体系的条件，具有重要意义。2.实验材料和仪器2.1菌种及质粒菌种为大肠杆菌和冰城链霉菌。（均由向文胜老师提供）质粒为pIJ8600（aac(3)IV,tsr,oripUC18,oriT/RK2,tipAp,FC31int/attP，Sunetal，1999）2.2培养基（1）LB养基:胰蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl1g，蒸馏水10