实验1：大肠杆菌的培养和分离.ppt

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1、实验1：大肠杆菌的培养和分离微生物单细胞原核，分支状的菌丝（基内~、气生~）放线菌单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体（种群）菌落是鉴定菌种的重要依据菌落芽孢：细菌的休眠体芽孢结构异养型，兼性厌氧型，革兰氏阴性(红色)(G-)物质(元素)组成：CHONPS…大肠杆菌按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。培养基类型液体培养基固体培养基凝固剂琼脂扩大培养，工业生产分离纯化，鉴定菌种，计数，保藏选择培养基鉴定培养基天然培养基合成培养基成分作用主要来源碳源主要作能源物质无机碳(CO2

2、)或有机碳(糖类)氮源合成含N类化合物N2，NH3，铵，硝酸盐尿素，牛肉膏，蛋白胨无机盐调节渗透压等水生长因子调节促生长维生素，AA，碱基等培养基成分消毒：较为温和的方法，如酒精注：消毒不能杀死芽孢灭菌：强烈，所有，完全无菌灭菌消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。无菌技术1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min（牛奶）3、化学药剂消毒法:用70%酒精进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线消毒（空气）(1)常用消毒的方法：(2)常用灭菌的方法：1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-17

3、0℃下加热1-2h。3、高压蒸汽灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.称量-计算-溶化-灭菌-倒平板灭菌：加上封口膜，用牛皮纸包好放在高压蒸汽灭菌锅中灭菌，1Kg压力灭菌15Min步骤一：制备LB培养基(液)倒平板步骤一：制备LB培养基(液)紫外灯，过滤风，酒精灯，酒精棉球在火焰旁右手3指拿锥形瓶，2指拿封口膜使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置倒平板过程总结从大肠杆菌斜面→锥形瓶中的液体培养基接种好后在37度摇床振荡培养12h工具：接种环在接种前要灭菌步

4、骤二：大肠杆菌的扩大培养分离方法：平板划线分离法原理：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。只能蘸一次、再次划线从上次末端开始、划好倒置培养1-2天、划线末端出现不连续的单个菌落步骤三：大肠杆菌的分离纯化平板划线接种灼烧接种环冷却划线（第一区域）蘸取菌液灼烧接种环冷却划线（第二区域）灼烧接种环冷却划线（第三区域）灼烧接种环冷却划线（第四区域）灼烧接种环冷却划线（第五区域）灼烧接种环平板倒置放置培养第一区域第二区域第三区域第四区域第

5、五区域1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作

6、时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。将单菌落用划线法接种到斜面，37度培养24h后放入4度冰箱保藏步骤四：接种到斜面保存分离的另一种方法：稀释涂布平板法稀释涂布法:(1)系列稀释操作:分离的另一种方法：稀释涂布平板法1.进行恒温培养时，为什么要将培养皿倒置？恒温培养时，培养基的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放培养皿，则水份形成的水滴会落入培养基表面并且扩散

7、开。如果培养基中已经形成菌落，则菌落中的菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单个菌落，达不到分离的目的。2.实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？实验完成后，所有接触过细菌的器皿都必须先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基，有可能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体影响人畜健康，也污染环境，因此必须高压灭菌。使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。对于取样器的取样头，通常是灭菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤纶30min,再用清水洗净，仍可再用。封口膜也可再用。3.如果分离的是转基因的工程菌，如何保证没有被普通的大肠杆菌污染？转基因用的质粒，不是细菌中原

8、有的质粒，而是通过改造的，通常加入了抗性基因，如抗氨苄青霉素基因。转基因质粒转化