蛋白质的分离与纯化.ppt

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1、生物化学蛋白质的分离、纯化与表征CollegeofLifeScience1蛋白质的酸碱性质2蛋白质分子的大小与形状3蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀4蛋白质分离纯化的一般原则5*蛋白质分离纯化的方法6蛋白质含量的测定与纯度鉴定一、蛋白质的酸碱性质蛋白质与氨基酸相似，也具有两性电离的性质。蛋白质的多肽链含有末端氨基和羧基，一些侧链上含有可解离的基团，有的可以接受氢离子，有的可以电离出氢离子，因此蛋白质具有酸碱两性电离的性质。它的两性电离比氨基酸复杂。对某一蛋白质而言，在某一pH下，当它所带正负电荷相等的时候，该溶液的pH就称为该蛋白质的等电点。蛋白质的等电点的大小与蛋白质

2、的氨基酸组成有关。二、蛋白质的大小与形状π:渗透压R:气体常数T：绝对温度c:溶质的浓度（g/m3）π/c对c作图，在c趋近于零时得出Mr菲克第二定律扩散不仅与蛋白质的分子量有关，还与分子形状有关由于浓度差异引起的溶质分子的净迁移成为平衡迁移或者迁移。菲克第一定律离心机类别低速离心机高速离心机超速离心机①离心力“F”当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“F”由下式定义，即：a-粒子旋转的加速度，m-沉降粒子的有效质量，ω-粒子旋转的角速度，r-粒子的旋转半径(cm)。②相对离心力“RCF”相对离心力是指在离心场中，作用于颗粒的离心力

3、相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度“g”（980cm/sec2）,“RCF”相对离心力可用下式计算：RCF=1.119×10－5×(rpm)2r(rpm—revolutionsperminute每分钟转数，r/min)③离心机转速与离心力列线计算图一般情况下，低速离心时常以转速“rpm”来表示，高速离心时则以“g”表示。在报告超离心条件时，通常总是用地心引力的倍数“×g”代替每分钟转数“rpm”.转速与离心力的换算:先在r标尺上取已知的半径和在rpm标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，与图中RCF标尺上的交叉点即为相应的相对离心力数值。超离心法类

4、别1#密度梯度离心法（densitygradient）2*沉降速度法（sedimentationvelocity）3*沉降平衡法（sedimentationeguilibrium）密度梯度离心法#生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有蔗糖、氯化铯等。蔗糖密度梯度蔗糖浓度离心管颗粒物质或溶质在超速离心场中的沉降速

5、率。用小写斜体s表示。s=v/a，其中a为重力或离心加速度，v为沉降速度，即沉降系数为每单位离心力场的沉降速度。在较低速度（8,000-20,000r/min）的离心场中，离心开始时，分子颗粒发生沉降，由于沉降的结果造成浓度梯度。因而产生了扩散作用，扩散力的作用方向正与离心力相反，当净离心力与扩散平衡时，在离心池内从液面到池低形成一个由低到高的恒定浓度梯度。如果测得相关参数即可算出生物分子的分子量。离心力x1轴心液面离心轴扩散力x2原理示意图Vt：柱床“总容积”，Vo：即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相容积Vi：即凝胶颗粒内部所含水相的容积。Vg：凝胶本身的容

6、积；Vt＝Vo十Vi十Vg或Vt-Vo=Vi十Vg，凝胶床总体积分配系数（Kd）0＜Kd＜1，Ve在Vo与Vo十Vi之间变化Ve：为实际测得的洗脱容积，自样品加入到组分最大浓度(峰)出现时所流出的容积Ve＝Vo十KdViVe=K1-K2lgMK1、K2为常数，Ve可用如下表达式代替，Ve-Vo（分离体积），Ve/Vo（相对保留体积），Ve/Vt（简化洗脱体积），Keff（相对洗脱体积）在不同型号凝胶上蛋白质的选择曲线的差异Ve与相对分子量的关系排阻范围的选择凝胶装柱①将层析柱垂直装载支架上，将下端输液管夹紧；②向柱中加入约1/3体积的0.9％NaCl溶液；③将一细玻

7、棒伸入柱内，靠近管内壁，顺着玻棒缓慢的向管内加入混匀的凝胶溶液；④凝胶加至层析柱顶端约3cm时，打开柱下端输液开关，使流速控制在0.25-0.5ml/cm2·nim。④连续而缓慢的加凝胶直到稳定在离管口约5cm处。（防止空气进入凝胶床）柱层析系统的安装凝胶层析中的分离行为蓝葡聚糖（兰色）、血红蛋白（红色）、铬酸钾(黄色)电泳蛋白质的沉淀使蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀，方法有：1.盐析：在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸胺、氯化钠、硫酸钠等，使蛋白质从溶液中析出，称为蛋白质的盐析。而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该