Primer Express TaqMan引物探针设计.pdf

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1、PrimerExpressTaqMan引物探针设计一、安装软件ABI公司PrimerExpressv3.0PrimersandProbeDesignForReal-TimePCR二、Primers/ProbesDesignGuidelineTaqManProbePrimerProbe与Primer的距离愈近愈好,PCR产物大小建议在50-150bp为最佳G/C%为30-80%避免有重复序列的出现，尤其避免4个以上G的出现Tm值:68-70℃(Quantificationassay)Tm值:58-60℃65-67℃(AllelicDiscriminationassay)Probe

2、长:Primer长:13~25bases(TaqManMGBprobe)20bases(Optimal)13~30bases(TaqManprobe)避免连续6个A的序列出现3’端的前5个序列里不能超过2个C+G5’端第一个序列不能为G(如果选择FAM-dye在5’端第二个序列也可以为G)b选择C比G多的strand当作probe避免3’端的前4个序列含有3个或以上Ga(GGG-MGB-3’orGGAG-MGB-3’)a避免probe的中间区域含有2个或以上的CCdi-nucleotidesa.针对TaqManMGB探针b.参数可选择设定三、Primers&Probes（Aut

3、omaticallyDesign）①进入PrimerExpress3.0软件File→New→选择TaqManMGBQuantification或TaqManQuantification→OK②Tools→按AddDNAFile，寻找序列存取位置，按下Add，将序列档案加入空白文件。亦可在Sequence的界面中使用Copy&Paste复制和粘贴或直接输入序列。*PrimerExpressSoftware只能接受dan,txt,ab1,或abi的档案格式，请事先将欲分析的序列存成纯文字档即可(若序列是从databasedownload下来时,请刪除与序列无关的资料)。③可勾选D

4、oubleStrand,即会显示doublestrandedDNAsequence。④各Tools选项操作1.Exclude:不必要的序列可利用ExcludeSelectedBases将序列划掉。-先选取不要的序列范围，点选“Exclude”，即可看见此区域被划掉。2.Junction:如果已经知道序列上junction位置则可利用Junction-选取juction的位置(必须含2bases)，再点选Junction，即可看见此区域被红色标记起来。3.在Parameters界面中可看到Primer/ProbeTm值设定及其他Primers/Probe情况。4.回到Sequen

5、ce界面，Tools→FindPrimers/Probes，软件即开始找寻找适当的Primers/Probepairs。*PrimerExpress软件会找到CandidatePrimers&Probepairs，一次search最多能找到50种组合，这些组合列与Primers/Probes界面中。中间Location说明primers&probes在序列中的相对位置，在横线上方的数字代表起始位置，橫线下方则代表终止位置。⑤Sequence界面中会显示出与Primers/Probes界面相对应的一对Primers/Probe:粉红色片段是Probe的位置，蓝色代表Forward

6、Primer，黄色片段则为ReversePrimer，如下图所示。(*但并不表示此为最佳的设计)。⑥在Primers/Probes界面中会将每对Primers/Probe的组合列出来，请从中挑选出适当的组合，挑选方式可依据之前的primer/probedesignguideline。在MGBProbe的筛选中,亦在Parameters界面中加选C比G多的序列作为进一步筛选的参数。⑦決定primer/probeset之后则可进行存档，存档的方式从File→SaveAs存档。如果想将所选择的primer/probeset单独储存,可利用Export→OrderInfo…的方式，或者

7、要储存50个Primers/Probes清单，可点选Export→Primers/ProbesList…，以上两种方式都可存成txt档案，在Excel中开启。