萘降解菌的分离、鉴定及降解途径.pdf

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1、第34卷第1期华中农业大学学报Vo1．34No．12015年1月JournalofHuazhongAgriculturalUniversityJan．2015，59~65萘降解菌的分离、鉴定及降解途径徐中阳陈雯莉华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉430070摘要从武汉市金口张公堤处污泥富集分离出2株能以萘为唯一碳源生长的优势降解菌株XA1和XB1，经形态学观察、生理生化鉴定及16SrDNA测序分析，确定它们属于荧光假单胞菌(Pseudomonaspuorescens)。其最适生长温度均为28℃，最适生长pH分别为7．5和7．0。在最适生长条件下，菌

2、株XA1、XB1以3的接种量对500mg／L萘的降解率在第3天时分别达到了93．4和74．7。采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术检测到xA1、XB1中有儿茶酚2，3-双加氧酶基因(nahH)等萘降解过程中的关键酶基因，与NCBI中发布的基因序列相比较，相似度均达到99。关键词多环芳烃；萘；降解；儿茶酚2，3-双加氧酶；荧光假单胞菌中图分类号Q939．9文献标识码A文章编号1000—2421(2015)010059—07多环芳烃(PAHs)是由2个或2个以上的苯环从油田污泥中分离出萘降解菌株的研究在国内还鲜以线形排列、弯曲连接或者聚簇状的方式构成的有见报道。本研究

3、以PAHs模式化合物萘为唯一碳机化学污染物，来源于石油、天然气、煤炭、工业废源，分离鉴定出2株荧光假单胞菌XA1和XB1，通水、废气等一些不完全燃烧的有机化合物中。由于过形态观察和16SrDNA序列比对分析，对它们在其高疏水性和化学稳定性，容易在人体内进行富集，最优条件下萘的降解效率和降解途径进行了测定和使人体致癌、致畸和致突变E，对人类健康和生态初步分析，以期为探讨菌株XA1和XB1的分子降环境构成重大危害，因此，被美国环保局列入了129解机制以及后期构建高效降解PAHs的工程菌株种优先控制环境污染物的黑名单[3]。尽管PAHs提供理论基础和现实依据。是公

4、认的难降解污染物，但已发现一些厌氧和好养1材料与方法微生物能够通过多种代谢途径将PAHs降解矿化，目前在污水、淤泥、土壤中均发现了能以PAHs为1．1试验材料唯一碳源和能源进行降解的微生物，微生物在土样：污泥样品1、2、3号均于武汉市金口张公PAHs迁移乃至最终降解过程中起到了重要作用，堤处进行定点采集，该处土壤长期受多环芳烃污染，因此，PAHs的生物修复越来越受到人们的重采集深度分别为1号土(A点)地下4m、2号土(B视l_4]。由于利用微生物降解PAHs的方法具有成点)地下1m、3号土(C点)地下3m，将采集到的土本低廉、二次污染少、修复彻底等优点，已成

5、为去除样放人无菌的牛皮纸袋中，密封，带回实验室置于环境中PAHs的理想手段[6]。目前研究人员从土4℃冰箱保存。壤中分离的萘降解菌株主要有Mycobacteriumsp．，试剂：萘、环己烷、蛋白胨、琼脂粉、酵母粉、NaC1、Alcaligenesdenitrificans，Pseudomonasputida，CaC12、K2HPO4、KH2PO4、(NH4)2SO4、MgSO4、P．vesicularis，P．Zuorescens，Rhodococcussp．，FeCl。、甘油等均购自国药集团化学试剂有限公司，Moraxellasp．等[7]。有研究表明，假

6、单胞菌所有试剂均为AR级；T4DNA连接酶购于Fer—(Pseudomonassp．)能有效降解PAHs_g，但是关mentas公司，MarkerIl购白天根生化科技有限公于该类高效快速的降解菌株报道的并不多，特别是司，引物、DNA产物纯化试剂盒购自上海生物工程收稿日期：2013—05—28基金项目：国家自然科学基金项目(41071180)徐中阳，硕士研究生．研究方向：土壤微生物学．E-mail：xzy2988970@163．corn通信作者：陈雯莉，博士，教授．研究方向：微生物学．E-mail：wlchen@mail．hzau．edu．cn60华中农业大学

7、学报第34卷技术有限公司。(500mg／L)无机盐MM液体培养基，将XA1和1．2菌株的分离与培养XB1接种于LB培养基中过夜活化，取一定体积的将污泥土样以l0的接种量接种于萘选择性2种菌悬液，用PBS磷酸缓冲液反复洗涤3次，以无机盐培养基中(KH2POl_33g，K2HPO41．753的接种量接种于50mL含有萘(500mg／L)的无g，NH4Cl1．00g，Na2SO42．00g，KNO32．00g，机盐液体培养基中，对照组(CK)只加菌液不加萘，MgSO4·7H2O0．2g，FeSO4·7H2O0．05g，在28、37℃下180r／rain振荡培养4d

8、，每隔12h测ZnSO4·H2O0．0428g，(N