实时荧光定量PCR技术的原理及应用.doc

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1、实时荧光定量PCR技术的原理及应用(图)一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。（二）实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进

2、行定量分析.4、几个概念：（1）扩增曲线：（2）荧光阈值：（3）Ct值：     CT值的重现性：5、定量原理：理想的PCR反应：  X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0(1+Ex)n     n：扩增反应的循环次数     X：第n次循环后的产物量     X0：初始模板量     Ex：扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1）确定未知样品的C(t)值2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的荧光标记：二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一：SYBRGreen法（一）工作原理1、SYB

3、RGreen 能结合到双链DNA的小沟部位     2、SYBRGreen 只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。PCR反应体系的建立及优化: 1、SYBRGreen使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 　　2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 　　3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物　　4、反应Buffer体系的优化　　5、反应温度和时间

4、参数:由酶和引物决定　　 6、其他与常规PCR相同（二）应用范围1、起始模板的测定；　　2、基因型的分析；　　3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。（三）优点及缺点优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA；使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。 缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；  对引物特异性要求较高。方法二：TaqMan---水解型杂交探针 **

5、5′端标记有报告基团(Reporter,R) ，如FAM、VIC等 　　**3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)　　**探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光　　**Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针（一）工作原理注意：每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光PCR反应的建立：1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，　　引物尽量靠近探针，扩增片段<400bp，引物Tm为59-60℃

6、2、反应参数的确定：一般为：94℃，10-20S　　 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）　　 也可通过温度梯度优化退火温度72℃，45S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值 　　引物浓度：50-900nM　　 探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同（二）优缺点优点：　　对目标序列的高特异性      　　 ------阴性结果确定　　设计相对简单      　　------与目标序列某一区域互补　　重复性比较好缺点：　　只适合一个特定的目标;　

7、　委托公司标记，价格较高;　　不易找到本底低的探针