基因重组与基因工程课件

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1、第十七章基因重组与基因工程(geneticrecombinationandgeneticengineering)基因重组是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程，又称DNA重组。基因克隆将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一DNA分子，称此为基因克隆、DNA克隆或分子克隆。基因工程实现基因克隆所采用的方法和相关工作，统称为重组DNA技术或基因工程。本章主要内容重要的工具酶基因克隆常用的载体重组DNA基本原理重组技术在医学和制药工业中的应用第一节重要的工

2、具酶工具酶基因工程中的工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、修饰、反转录等有关的各种酶系统。一、限制性核酸内切酶(RE)是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。根据限制酶的作用特性，一般分为三类：——Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中常用的是Ⅱ型限制酶。限制酶（Ⅱ型）识别及切割位点特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种缺口：5ˊ－粘性末端3ˊ－粘性末端平端或钝端回文序列是指该部位的核苷酸序列呈180O旋转对称;粘性末端是指经

3、内切酶特异切割后产生的5ˊ－末端突出或3ˊ－末端突出的碱基序列相互具有互补性。⑴产生5'-粘性末端5'-GAATTC-3'5'-GAATTC-3'+3'-CTTAAG-5'EcoRI3'-CTTAAG-5'⑵产生3'-粘性末端5'-CTGCAG-3'5'-CTGCAG-3'+3'-GACGTC-5'PstI3'-GACGTC-5'⑶产生平(头末)端/钝端5'-CCCGGG-3'5'-CCCGGG-3'+3'-GGGCCC-5'SmaI3'-GGGCCC-5'同裂酶（异源同工酶）其它特殊性质同尾酶的Ⅱ型限制酶可变酶同裂酶又称异源

4、同工酶。指来源不同，但具有相同的识别序列。在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切；切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端，称为同识异切。同裂酶——同识同切5'-TTTAAA-3'AhaⅢ5'-TTTAAA-3'+3'-AAATTT-5'DraⅠ3'-AAATTT-5'同裂酶——同识异切5'-GGTACC-3'5'-GGTACC-3'+3'-CCATGG-5'KpnI3'-CCATGG-5'5'-GGTACC-3'5'-GGTACC-3'+3'-CCATGG-5'Asp718I3'-CCATGG-

5、5'同尾酶5'-GATC-3'5'-GGATCC-3'5'-AGATCT-3'3'-CTAG-5'3'-CCTAGG-5'3'-TCTAGA-5'MboⅠBamHⅠBglⅡ同尾酶指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。可变酶可变酶识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，并且识别顺序往往超过6个碱基对。如，BstpⅠ，其识别顺序为GGTNACC。常用限制性核酸内切酶的特性微生物名称酶名称识别顺序同裂酶同尾酶BacillusamyloliquefaciensHBamHⅠGGATCCBstⅠBg

6、lⅡ解淀粉芽孢杆菌MboⅠBacilliusglobigilBglⅡACATCT球芽孢杆菌EscherichiacoliRYEcoRⅠGAATTC13大肠杆菌HaemophilusinfluenzaeHindⅢAAGCTTHsuⅠ流感嗜血菌Providenciastuartii164PstⅠCTGCAGSalpⅠ普罗威登细菌StreptomycesalbusSalⅠGTCGACAvaⅠSubspeciespathocidicusXhoⅠ白色链球菌二、DNA聚合酶（最常用的DNA聚合酶有以下4种）DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅰ大片

7、段——Klenow片段TaqDNA聚合酶T4噬菌体DNA聚合酶㈠DNA聚合酶ⅠE.ColiDNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ）是一个具有3种酶活性的多功能性酶。包括：5ˊ→3ˊDNA聚合酶活性5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性DNApolⅠ应用⑴催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA探针；⑵第二条cDNA链的合成；⑶对DNA3’突出末端进行标记；⑷DNA序列分析。E.coliDNApol.Ⅰ催化切口平移5'3'3'5'2+DNaseIMg5'3'5'3'3'dATP,dCTP,dGTP5'E.coliDNAPOL

8、I[α-32P]dTTP5'3'*T3'5'5'*T*T*T3'3'5'㈡Klenow片段（DNApol.大片断）Klenow片段用途5'3'⑴补齐双链DNA的双链DNA3'5'3ˊ末端；外切酶Ⅲ⑵用标记碱基补5'3'5'-粘端齐3ˊ末端；3'5'KlenowDNA聚合酶[α