exp.5-akp比活性的测定

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1、（AKP比活性测定）Exp.5SpecificactivityassayofAKP[目的要求]1、学习酶的活性、比活性的测定方法；2、掌握酶的活性、比活性、得率、纯化倍数的概念Purpose1、Learnthemethodoftheassayofenzymeactivityandspecificactivity2、Mastertheconceptsofenzymeactivity,enzymespecificactivity,yieldandthefoldsofpurification概念：1、酶活性：酶所具有的催化能力(对特定化学反应

2、)。本实验中,酶活性单位是AKP在37℃下保温15min产生1mg酚者为1个酶活性单位酶活性单位：2、酶的比活性：单位重量的protein样品中所含酶活性的单位数（U/mg）。用来表示酶被纯化的程度同一种酶，比活性愈高，表明酶愈纯。3、纯化倍数：衡量纯化效果的指标4、得率：评价一种纯化方案的指标AKP比活性=AKP活性单位数/ml蛋白质（mg/ml）纯化倍数=各阶段比活性数匀浆液（A液）比活性数得率=各阶段酶的总活性单位匀浆液（A液）中酶的总活性单位×100%Theexpressions:O-P=OONaONa磷酸苯二钠+H2OAKPO

3、HHO-P=OONaONa+C6H5NH3C-NH3C-CC-NH2C=OH3C-NOH+C6H5NH3C-NH3C-CC-N=C=OH3C-NOK3Fe(CN)6OH-4-氨基安替比林醌衍生物Principle（原理）1.2.注意：①准确保温15min（从加第一种酶液开始计时）②充分混匀③吸取基质液和酶液量要准确Methods1.ActivityassayofAKP(AKP酶活性测定)④比色时注意波长是500nm还是510nm1.ActivityassayofAKPA1B1COs0.04mol/lbase(ml)1.001.001.0

4、01.001.00TAEbuffer（PH8.8)（ml）0.800.800.801.000.90Hydroxybenzenestandardsolution（ml）00000.10mixupthesolution,reactat37℃for5minEnzymesolution(ml)0.200.200.2000mixupthesolution，timeimmediately，reactat37℃forright15min0.5mol/lNaOH(ml)1.001.001.001.001.000.3%4-AAp(ml)1.001.001

5、.001.001.000.5%K3Fe(CN)6(ml)2.002.002.002.002.00（酶活性测定）A1B1CO标酶活（酶单位/ml）=×0.1×0.1××稀释倍数OD测OD标10.2酚标准浓度酚标准体积酶液体积AA120倍BB110倍1、enzymeactivityλ=510nm2.QuantitationofProteins----TheLowryMethodA2B1COsEnzymesolution(ml)0.200.200.2000Standardprotein（ml）00000.400.9%NaCl(ml)0.80

6、0.800.801.000.60Folin-A(ml)5.005.005.005.005.00mixupthesolution,reactatRT(roomtemperature)for10minFolin-B(ml)0.500.500.500.500.50mixupthesolution,roomtemperaturefor30min(蛋白质含量的测定——Lowry法_)λ=500nmA2B1CO标蛋白浓度（mg/ml）=×0.1××稀释倍数OD测OD标10.2酶液体积标准蛋白的量0.25mg/ml×0.4ml=0.1mgAA280倍

7、BB110倍2.QuantitationofProteins----TheLowryMethod(结果)AKP比活性=AKP活性单位数/ml蛋白质（mg/ml）纯化倍数=各阶段比活性数匀浆液（A液）比活性数得率=各阶段酶的总活性单位匀浆液（A液）中酶的总活性单位×100%有效数字保留3位ResultsTheexpressions:Fillthetable（P21）[思考与讨论]1、思考题（P22）2、讨论：根据实验结果分析讨论其可能的原因。（参考上次实验的每一步骤）TSGZ0004-2007(1)基本格式统一封面、目录、鉴定评审结论、

8、明细表(2)有关填写要求见附件G4343谢谢大家