第六讲 dna的提取原理及提取技术

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1、DNA的提取原理及提取技术天然DNA的来源：1染色体DNA原核生物和真核生物均含有染色体DNA,它是分离目的基因和基因表达调控因子的主要材料。2病毒和噬菌体DNA主要用于构建基因克隆载体，也可作为分离目的基因和基因表达调控因子的材料。3质粒DNA很多微生物（大肠杆菌、农杆菌和蓝细菌）都含有质粒DNA，主要用于构建基因克隆载体，也可作为分离目的基因和基因表达调控因子的材料。4线粒体和叶绿体DNA这是真核生物特有的染色体外遗传物质，分别含有与呼吸作用和光和作用相关的基因。主要用于分离目的基因。植物细胞的化

2、学成分主要有:1水、糖类、蛋白质、脂肪以及核酸是生物体所需的基本成分；2氨基酸是合成蛋白质的基本原料；3果胶、纤维素、半纤维素是植物细胞壁的组成成分；4淀粉是光合作用的产物；5金属离子主要用来调节细胞的渗透平衡等，比如钾和钠，镁和锰是叶绿素的成分。植物总DNA提取原则保证DNA结构的完整性排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染植物DNA提取的基本原理DNA特点：DNA是极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。在酸性溶液中，DNA易水解，在中性或弱碱

3、性溶液中较稳定。DNP在盐溶液中的溶解度随着盐浓度的增加而增加。植物DNA提取的基本原理DNA提取基本步骤：1细胞裂解和DNA的溶解主要任务：破碎细胞并对DNA实施保护。采取措施：⑴利用液氮研磨，使酶失活；⑵快速加入缓冲液并迅速混匀，对细胞溶浆中DNA进行保护。EDTA—螯合DNA酶的辅助因子Mg2+和Ca2+,使DNA酶活性降低；SDS—使蛋白质变性并降解蛋白质，也可降低DNA酶的活性；抗氧化剂—降低酚类氧化对DNA的干扰；PVP—与多酚形成复杂的聚合体，与多糖结合，有效去除多糖；。。。。。。植物D

4、NA提取的基本原理2与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除；主要利用DNA与蛋白质、多糖等在生化性质上的差别，通过加入离子变性剂，去污剂使蛋白质或多糖变性，核蛋白解聚。CTAB十六烷基三甲基溴化铵SDS十二烷基磺酸钠除蛋白质氯仿/异戊醇抽提（氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡）。使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤(当溶液中的中性盐的浓度大于1mol/L时，蛋白质会沉淀析出.)蛋白酶处理除多糖高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积

5、的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。除酚类物质在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合除各种离子70％的乙醇洗涤注意：我们在提取某种植物DNA时，需要考虑以上各种杂质的存在，根据某种植物DNA的具体情况采取相应的去除杂质的方法。植物DNA提取的基本原理3DN

6、A的沉淀和纯化沉淀：无水乙醇TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl,1mMEDTA.pH8.0）作用：①TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase②PH值为8.0，可防止DNA发生酸解DNA的纯化技术琼脂糖凝胶电泳洗脱法主要用于小剂量DNA的纯化和酶切片段的回收。1DNA样品在琼脂糖凝胶电泳分带后，切取含有待纯化DNA带的琼脂糖凝胶电泳块，装入透析袋中；2透析袋中加入适量经稀释的电泳缓冲液，并置于稀释的电泳缓冲液中电泳1-2h，使DNA脱离琼脂糖凝胶；DNA的纯化技术琼脂糖凝胶

7、电泳洗脱法3再反向电泳30s-1min，使附着在透析袋膜上的DNA重新进入缓冲液中；4吸取透析袋中的洗脱液置于离心管中，以10000r/min离心5min,转移上清液到另一个离心管中，加入3MNaAc，再加入2体积无水乙醇，-20℃放置1.5min以上；DNA的纯化技术琼脂糖凝胶电泳洗脱法54℃，12000r/min离心20min，弃上清，沉淀在空气中晾干，溶于TE中，-20℃保存备用。DNA提取技术一、染色体DNA的提取CTAB法（hexadecyltrimethylammoniumbromide，

8、十六烷基三甲基溴化铵）SDS法（十二烷基磺酸钠，Sodiumdodecylsulfate,简称SDS）二、非染色体DNA的提取质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法CTAB法（植物DNA提取经典方法）原理：CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶