进境旅客携带的澳大利亚苹果中美澳型核果褐腐病菌的检测与鉴定-论文.pdf

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1、江苏农业科学2014年第42卷第6期一119一许萍萍，李彬，吴翠萍，等．进境旅客携带的澳大利亚苹果中美澳型核果褐腐病菌的检测与鉴定[J]．江苏农业科学，2014，42(6)：119—121进境旅客携带的澳大利亚苹果中美澳型核果褐腐病菌的检测与鉴定许萍萍，李彬，吴翠萍，漆少廷，罗朝科，罗建国，安榆林(1．南京出入境检验检疫局，江苏南京210011；2．江苏出入境检验检疫局，江苏南京210001)摘要：南京禄口国际机场口岸从进境旅客携带的澳大利亚苹果中截获疑似褐腐病果。瘸果表靠近果肩处有水渍状褐色病斑，经保湿培养后褐色病斑迅速扩展至全果，果实表面出现灰褐色绒状霉层

2、，果实腐烂。对病果进行分离培养、形态学观察、PCR检测及ITS序列分析和致病性测定后，将病菌鉴定为美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructico—)。这是江苏省首次从旅客携带的澳大利亚苹果中截获该检疫性有害生物。关键词：苹果病害；真菌鉴定；旅检；美澳型核果褐腐病菌中图分类号：$41—3文献标志码：A文章编号：1002—1302(2014J06—0ll9一o3褐腐病是桃、李、杏、苹果等果树上的一种危害严重的水每天检查，直至出现褐腐病斑症状，再对果实进行分离培养。果病害，引起该病害的病原菌之一的美澳型核果褐腐病菌1．3组织分离与培养(Moniliniafr

3、ucticola)是我国进境植物检疫性有害生物，该病取有褐色病斑的果实进行分离培养，用70％乙醇对果实原菌的主要寄主为蔷薇科果树，尤其以核果类李属(Prunus)表面进行消毒，等乙醇挥发后，从病健交界处切取或用镊子撕的李、杏、桃、油桃、樱桃、苹果、梨和葡萄等果树受害最严重，取边长为5—10mln的样品，放在PDA培养基上，25℃培养，曾对北美和澳大利亚的核果造成巨大损失。美澳型褐腐病菌待菌落出现镜检。既能在果园中引起危害，又能危害储藏期果实，并可在果实中1．4形态学观察与生物学鉴定潜伏侵染，随病果远距离传播，美澳型核果褐腐病菌目前在日如果菌落上的分离物形态特征

4、与美澳型核果褐腐病菌相本、印度、韩国、美国、加拿大、澳大利亚、新西兰、法国等多个似，则对疑似菌株进行纯化，并对菌落的颜色、生长速度、产孢国家均有分布，我国北京和台湾地区也有局部发生危害的报量和孢子堆的形状等菌落形态学特征和生物学性状进行观察道⋯。该病菌可随带病的苗木及水果通过贸易和旅客携带和测定。先将转到PDA上的美澳型核果褐腐病菌疑似菌株进行远距离传播。2013年6月，南京禄口国际机场口岸从进放在22℃下暗培养4d，用4am的打孔器在菌落边缘打孔境旅客携带的澳大利亚苹果中截获一批可疑病果。为防止美取样，将菌落转移至直径为9cm的PDA培养皿中央，22℃下澳型

5、核果褐腐病菌传人我国，笔者对病果及其分离物进行了12h光照／12h暗培养，光照波长为320—380am、18W黑光分离培养、病原菌形态学观察、PCR分子检测，并遵循柯赫氏灯(近紫外灯)2盏，置于培养皿上方约15cm处，培养3d后法则进行致病性测定，对这批病苹果携带的病菌进行了检测开始每天测量菌落直径，直到第5天开始计算并记录菌落的和鉴定。生长速度、颜色、产孢量、孢子堆形状。1．5分子生物学鉴定1材料与方法1．5．1DNA提取采用Tooley等的碱裂解法直接从培养1．1材料与试剂基中快速提取菌丝DNA。疑似菌株经纯化后在PDA上生长材料为南京禄口国际机场从进境旅

6、客携带的澳大利亚苹2d，取菌丝块放入2mL的离心管中，加入50的0．5mol／L果中截获的可疑病果。培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)NaOH和2粒以上直径为3mill的钢珠，在球磨仪(Retsch培养基。MM400，德国)上以30f／s的频率振荡180s，12000r／min离1．2症状检查及保湿培养心5min，取10上清液直接溶于90100mmol／LTris溶对可疑病果的症状进行观察，取有褐色病斑的果实直接液(pH值8．0)中。也可以采用CTAB方法或真菌基因组提进行分离培养。病果初期有褐色病斑，温度适宜时，褐色病斑取试剂盒(如DNeasyPlantMi

7、niKit，QIAGEN，德国)提取病菌迅速扩大至全果，果肉随之变软腐烂。潮湿条件下，病果表面DNA。DNA提取后直接进行PCR检测或一20℃保存备用。凹陷处有灰色霉层，其上产生分生孢子梗束。有些潜伏侵染1．5．2PCR引物根据文献[1]中推荐的方法，对分离到的的果实表面暂时无明显症状，对这类果实可进行保湿培养，将疑似菌株采用PCR检测方法进行鉴定。美澳型核果褐腐病果实放在密闭的塑料盒中，20～25℃下保湿培养，7d后开始菌的特异性引物ITS1一Mfcl和ITS4一Mfcl序列为5TAT—GCTCGCCAGAGGATAATF一3和5一TGGGTrrrGGCAG

8、A—AGCACACT一3，预期扩增的P