进境旅客携带物中大豆黄化普通花叶病毒的检测-论文.pdf

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1、第39卷第5期植物保护学报Vo1．39No．52012年1O月ACTAPHYTOPHYLACICAsINICAOct．2012进境旅客携带物中大豆黄化普通花叶病毒的检测DetectionandidentificationofSoybeanyellowcommonmosaicvirusfromtheimportedsoybeanseedswithinpassenger’Sbaggage吴东妮陈舜胜于子翔杨翠云朱雅君于翠(1．上海出入境检验检疫局，上海200135；2．上海海洋大学，上海201306)WuDongni-ChenShunshengY

2、uZixiangYangCuiyunZhuYajunYuCui(1．ShanghaiEntry—ExitInspectionandQuarantineBureau，Shanghai200135，China；2．ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306，China)大豆黄化普通花叶病毒(SoybeanyellowcommonGTGAGTAAGAGTCGTAT一3。RNA提取和RT—PCRmosaicvirus，SYCMV)是新近报道的南方菜豆花叶方法参考于翠等J。PCR扩增反应条件：94℃预变病毒属Sobom

3、ovirus的一个种⋯。SYCMV自然寄主性3min；94oC变性30S，55℃复性45S，72℃延伸45范围较窄，主要侵染大豆和中国野生大豆，引起叶片S，35个循环；72℃延伸7min。保存于25℃备用。黄化和花叶等症状，可通过种子以及叶甲等昆虫介1．3SYBRGreen实时荧光RT．PCR反应体传播，也可摩擦接种J。Nam等通过全基因SYBRGreen实时荧光RT—PCR反应条件：95。【=组序列测定、侵染性克隆构建及系统进化分析等确预变性15min；95oC10S，60℃30S，共40个循环。认SYCMV基因组为单分体正义RNA，共有约

4、4000最后增加熔解过程。个核苷酸，编码1个30kD的外壳蛋白。目前，仅有1．4检测方法灵敏度的比较SYCMV在韩国发生危害的报道，尚未见有关SYCMV提取带毒大豆总RNA，以焦碳酸二乙酯(dieth—检测方法的相关报道。SYCMV与我国进境检疫性有ylpyrocarbonate，DEPC)处理水做lO倍梯度稀释后害生物南方菜豆花叶病毒(Southernbeanmosaicvirus，分别反转录合成cDNA，用于比较RT—PCR和SYBRSBMV)全基因组序列的同源性达到72．9％，而sB．Green实时荧光RT．PCR的灵敏度。MV侵染豆科

5、植物后导致种子重量和数量显著下2结果与分析降，因此，对进境植物种苗中SYCMV的检测应予以2．1RT-PCR检测重视。本试验以截获旅客携带的大豆作为待测样从变色、皱缩的大豆样品中提取总RNA进行反品，根据已经公布的SYCMV的序列设计特异性引转录后，以SYCMV．199F／R特异性引物进行PCR扩物，建立针对SYCMV的RT．PCR和SYBR—Green实增。从该样品中扩增到了预期的199bp特异性条时荧光RT—PCR检测方法。带，而从健康和阴性对照中无扩增条带。将扩增条1材料与方法带测序后与GenBank数据库中已公布的SYCMV的1．1材

6、料CP基因组序列比对分析，其同源性为96．2％。从截获的大豆种子中挑选表皮变色或皱缩的种2．2SYBRGreen实时荧光RT—PCR检测子，用冷冻混合球磨仪研成粉末，用于检i贝4。以带毒大豆的cDNA为模板，用特异性引物1．2反转录聚合酶链式反应SYCMV一199F／R进行SYBRGreen实时荧光RT—根据GenBank已公布的SYCMVCP基因序列PCR扩增，可得到标准s型曲线和具有单一峰的熔设计特异性引物，条带大小为199bp。上游引物：5．解曲线，而健康对照没有荧光吸收值，这说明设计的CATAGCGAACACTITGGAAC-3，下游

7、引物：5一AGA．引物特异性较好。基金项目：国家质检总局科技项目(2011IK172)作者简介：吴东妮，女，1987年生，硕士研究生，研究方向为植物病毒检测，E—mail：wudongni0719@126．corn通讯作者(Au~orforcorrespondence)，E—mail：yuc@shciq．gov．cn收稿日期：2012—05—17478植物保护学报39卷2．3灵敏度比较稀释至10时才无扩增，由此可见SYBR—Green实当模板RNA稀释至10时，RT—PCR还有隐约时荧光RT—PCR的灵敏度比RT—PCR高约100倍的条带，而

8、SYBR—Green实时荧光RT—PCR在RNA(图1)。Ml234567892000100075050025010O5l0l5202530354O循环数Cycle