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1、天然产物研究与开发Vol.11No.3NATURALPRODUCTRESEARCHANDDEVELOPMENT17抗肿瘤药物筛选中MTT法和SRB法的比较谭卫东金红罗弟祥钟绍东苏芝彭旭东高小平(中国科学院成都地奥制药公司成都610041)摘要在抗肿瘤药物的体外筛选中,MTT法和SRB法是常用的两种方法。我们用MTT法和SRB法分别测定3种已知植物抗癌药对22株人肿瘤细胞的抗癌活性,对这两种方法进行了详细的比较。通过分析两种方法测出的细胞存活率(TöC)的差异分布和相关系数以及IC50的二变量分布,比较了两种方法测定结果的异同;通过两种方法重复测定3种药物对7株人癌细胞的抗癌活性,比较了两
2、种方法的重复性;通过分析两种方法测定结果TöC值随时间变化的程度,比较了两种方法测定结果的稳定性。实验结果表明:MTT法和SRB法的相关性较好,都可用于抗肿瘤药物的体外筛选,SRB法更适合于大规模筛选,3种抗癌药物的测定结果与临床资料基本一致。关键词MTT法,SRB法,抗肿瘤药物体外筛选抗肿瘤药物筛选是抗肿瘤药物研究工作中非常重要的一个环节,建立合理的筛选体系,提高筛选质量,发现新的抗癌药物,是90年代肿瘤药理研究的一项重大课题。美国国立肿瘤研究[1]所目前使用的筛选方法是针对某种肿瘤病而不是以肿瘤总体为对象,这种方法用60种人体瘤细胞系作为筛选用模型,组成一个“板块”。此板块按肿瘤病种
3、种类再分成白血病、黑色素瘤、肺癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌及中枢神经系统癌等7个亚板块。如果某种受试药物的细胞毒作用具有亚板块特异性,则可能发现对某种(些)肿瘤具有选择性的抗肿瘤药。在此基础上,辅以针对机理的生化筛选测定,并用体内模型复筛,就可以筛选出有效的抗癌药物,用于临床试验。[2][3]我们建立了“板块”筛选方法,用MTT法和SRB法在体外初步测定药物对癌细胞杀伤作用的选择性。在本文中,我们通过测定目前国内厂家生产并已用于临床的3种植物化学抗癌药对肿瘤细胞的抑制作用,对这两种方法进行了详细的比较。1材料与方法111材料细胞:从我室保存的来自9种肿瘤(包括白血病、黑色素瘤、肺癌、结肠癌、
4、肾癌、卵巢癌、中枢神经系统癌、前列腺癌和乳腺癌)细胞中,每种随机选择2～3株,共22株人癌细胞株。药物:高三尖杉酯碱注射液为杭州民生药厂出品,批号为97061722;注射用硫酸长春新碱为上海华联制药公司出品,批号为950501;足叶乙甙注射液为连云港制药厂出品,批号为980512。MTT和SRB染料均购自SIGMA公司,其余试剂为市售分析纯。收稿日期:199920120718天然产物研究与开发Vol.11No.3112方法11211接种细胞:消化处于指数生长期的细胞,用含10%小牛血清的RPMI1640配成混悬液。将细胞分到96孔板中,每孔含5000～40000个细胞,在37℃,5%CO
5、2中培养24h。-4-5-6-7-811212加药:受试药物以10倍稀释,作5个稀释度,如10,10,10,10,10molöL,加入96孔板,在37℃,5%CO2中培养48h。11213结果测定:用MTT法和SRB法同时测定同一种药物,比较两种方法测得结果之间的差异;分别用MTT法和SRB法复试同一种药物,判定两种方法各自的重复性高低。[4]MTT法和SRB法操作程序如下:1d2d4hMTT法:接种细胞预培养药物处理加MTT加DMSO溶解570nm读数1d2d1h干燥SRB法:接种细胞预培养药物处理TCA固定水洗5遍加SRB染色15min干燥醋酸洗涤5遍Tris溶解490nm读数112
6、14数据分析11细胞存活率分析分析两种方法同时测定某种药物所得到的细胞存活率(以TöC%表[5]示,T为加药细胞的OD值,C为对照细胞的OD值),分析其差异分布。用一般相关系数法[6]和Pearson相关系数法分析MTT法和SRB法间的相关系数。MTT法和SRB法的重复性试验是在第一次试验的基础上,从22株细胞中随机选取7株,分别测定3种药物的抑制作用,与第一次测定结果相比较,分析其差异分布,并用一般相关系数法和Pearson相关系数法分析MTT法和MTT法,SRB法和SRB法两次测定结果间的相关系数。[7]21-1gIC50的二变量分析比较MTT法和SRB法测定得出的IC50,计算二变
7、量分布。31MTT法和SRB法测定结果的稳定性比较随机选取两种方法同时测定3种药物的96孔板,染色后按0h,2h,16h,24h测定其OD值,将2h,16h,24h所得OD值与0h比较,分析TöC值随时间的变化。41药物对肿瘤细胞抑制作用的分析根据药物对22株肿瘤细胞的IC50值,分别算出9类肿瘤细胞的平均IC50,以此判定药物对肿瘤细胞抑制作用的选择性以及抑制作用的程度。2结果211TöC率的比较MTT法和SRB法测定结果的比较分
