实验八聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳.doc

《实验八聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、实验八聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳【实验目的】1.掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。2.学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术，用于分离蛋白质。【实验原理】CH2=CH聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺作为支持物的一种电泳形式。单体-丙烯酰胺和交联剂-甲叉双丙烯酰胺相互作用可形成聚丙烯酰胺，该聚合反应以TEMED作为催化剂，以APS作为引发剂。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的比例可决定凝胶网孔的大小，交联剂所占比重越大，凝胶的网孔就越小。b5E2RGbCAPC=ONH2C=ONHCH2C=ONHCH2=CH+APTEMEDNHC

2、H2C=ONHCH2—CHC=ONH2—CH2—CHC=ONH2—CH2—CH—C=ONH2—CH2—CHC=ONH2—丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺p1EanqFDPwCH2=CH—CH2—CH—C=OCH2—CH—利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离主要依据以下两个因素：蛋白质所带静电荷：在不同的pH条件下蛋白质所带电荷不同。在一定的电场条件下蛋白质将向与其所带电荷相反的电极方向移动，移动速率取决于蛋白质表面电荷的数量，电压越强或电荷越多则蛋白质移动的越远。其次，蛋白质的形状和大小：蛋白质在电泳中所受的阻力主要

3、取决于样品的大小与凝胶网孔大小之间的关系。蛋白质分子越小或凝胶网孔越大，所分离样品所受阻力就愈小，则在电场中的迁移率就越大。在非变性电泳中，天然蛋白质的分离就是蛋白质所带电荷、分子大小及分子形状等因素共同影响，作用的结果。DXDiTa9E3d电压x样品静电荷迁移率= 摩擦力浓缩效应可显著提高聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率，该效应可通过引入浓缩胶和不连续缓冲溶液系统而获得。浓缩胶处于分离胶的顶部，因此样品在进入分离胶之前首先要经过浓缩胶。它是由较低浓度的丙烯酰胺构成，当样品经过浓缩胶时由于胶内网孔较分离胶网孔大，样品的移动

4、速度较快，最终使样品“堆积”在浓缩胶和分离胶之间。RTCrpUDGiT另外，浓缩胶还具有比分离胶更低的pH。浓缩胶内的缓冲溶液是Tris-HCl。分离胶内的缓冲溶液是pH9/98.9的Tris-HCl，而电泳正负两极的缓冲溶液均为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲溶液。在浓缩胶中，小分子并带有大量负电荷的Cl-在凝胶中的移动速率较快，而电荷较少且分子量较大的甘氨酸的移动速率较慢。由于二者在同一电场中，具有相同的电流，由此形成的电压梯度导致甘氨酸离子始终跟随在Cl-的

5、后面，带有负电荷的蛋白质样品则浓缩在甘氨酸离子和Cl-之间向正极移动。当样品进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸的解离度增加，在电场中的迁移率高于样品，蛋白质不再夹于两种离子之间向正极移动，这时的蛋白质依靠分子筛效应和电荷效应进行分离。5PCzVD7HxA样品缓冲溶液Tris/HClpH6.7Tris/甘氨酸pH8.9-+Tris/甘氨酸pH8.9分离胶Tris/HClpH8.9浓缩胶Tris/HClpH6.7【实验材料】jLBHrnAILg1.实验器材Bio-Rad公司Mini-ProteanⅡ型电泳仪；电源<电压20

6、0V，电流500mA）；100℃沸水浴；Eppendorf管；微量注射器<50μl或100μl）；带盖的玻璃或塑料小容器；摇床。xHAQX74J0X2.实验试剂试剂号配方pH1分离胶缓冲溶液1mol/LHCl48.0ml三羟甲基氨基甲烷36.3g加蒸馏水到100ml8.92单体交联剂丙烯酰胺

7、溶液甘氨酸28.8g三羟甲基氨基甲烷6.0g加蒸馏水到1000ml,用前稀释10倍8.37染色液CBBG-2500.1g溶于95%乙醇后，加蒸馏水到100ml8示踪染料溴酚蓝0.05g溶于100ml蒸馏水9样品：蛇毒干粉200mg溶于20ml,pH6.7缓冲溶液<5）中，再加入25%蔗糖20ml和溴酚蓝<8）10ml凝胶溶液的配方试剂分离胶125蒸馏水341.252.5-6.1950.050.005-1.01.257.640.100.005总体积

8、操作】1.凝胶柱的制备取l0cm×0.6cm的玻璃管，选择较平整的一端为底端，量取7.5cm、8cm两处，画线；底端管口用小块胶布封口，插入橡皮垫中，垂直放置于试管架中。用巴斯德滴管吸取分离胶，缓慢贴壁加胶到管内7.5cm处，立即加蒸馏水至8cm处。待分离胶凝固后，将胶面上的水分甩掉，残留的水分用滤纸条吸干，用滴管速加浓缩胶到分离胶面上至8cm