RNA干扰抑制RANKL基因治疗大鼠局部骨质疏松的实验研究.doc

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1、RNA干扰抑制RANKL基因治疗大鼠局部骨质疏松的实验研究摘要：目的：观察体外筛选出的带有sima片段的具有高效抑制rnakl表达的慢病毒颗粒对大鼠局部骨质疏松是否具有治疗作用。方法：将健康雌性sd大鼠40只随机分为4组，分别为（+）病毒治疗组、（・）病毒对照组，生理盐水对照组和空白组，每组10只，空白组为假手术组。进行局部骨质疏松造模，13周后开始给药，给药12周后，处死测血清指标血钙（ca）、血磷（p）、碱性磷酸酶（alp）,双侧股骨近端骨密度。结论：通过慢病毒载体介导rna干扰抑制大鼠rankl基因的表达是成功的。rna

2、i技术可成功的对骨质疏松大鼠大鼠起到治疗作用。关键词：rna干扰技术;rankl基因;骨质疏松；骨质疏松（osteoporosis,op）是一种全身性骨量减少、骨组织微细结构被破坏、骨脆性增加和易于骨折的代谢性疾病。它与机体的骨重建失衡冇关，破骨细胞的骨吸收的速度超过骨质形成速度导致骨质疏松⑴。本研究即釆用带有冃的基因的慢病毒颗粒进行局部注射治疗，通过対血清指标、骨密度检测，验证其是否具冇抑制局部破骨细胞的破骨作用，为临床治疗骨质疏松症奠定实验基础。1、材料和方法2.1实验动物及仪器将成年的、雌的sd大鼠40只（内蒙古大学动物

3、实验中心），体重在100g左右，分为4组：（+）病毒治疗组、（・）病毒对照组，生理盐水对照组和空白组，每组10只，空白组为假手术组。双能x线骨密度仪：美国hologic公司。全自动生化仪（口本东芝）。1.2慢病毒载体的构建由试剂公司根据已知rankl基因序列按sirna序列原则包装慢病毒载体。(+)慢病毒所携带的基因序列：5，—3'gcgcagauggauecuaacadtdt(-)慢病毒所携带的基因序列：5'—3'uucuccgaacgugucaegutt,并且在体外已证实具有沉默rankl基因的作用［2］。1.3造模及治疗

4、大鼠用10%的水合氯醛以3ml/100g行腹腔注射，麻醉满意后，将大鼠仰卧位固定于事先制作的老鼠手术台上，于腹股沟正中处做纵切口，长约2cm,切开皮肤及皮下筋膜，水平切断左侧股神经，靠近上段予以切除5mm,并作神经断端打结，缝合切口。再将大鼠取俯卧位固定于手术台上，在股骨大转子与靠近尾部之间与后外方45。方向行长约lcm的切口，暴露坐骨神经，靠近近端予以切除5mm,并作神经断端打结，缝合切口。普通喂养13周后给药⑶。1.4标本获取治疗12周后，麻醉大鼠，先采用双能x线骨密度仪测双侧股骨骨密度。再用心脏体外采血法对每只大鼠采血3

5、ml,离心，测血清ca、血p、alp,记录数值。1.5统计学方法：以上实验结果数据应用数据spss19.0统计软件分析，结果以均数土标准差(X±s)的形式表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较釆用t检验，，p<0.05为差异具有统计学意义。2、结果2.1血清ca、p、alp的测定结果各组血清ca、p、alp检测值均在正常范围，血清ca、p组间比较差异无统计学意义(p&0.05),同组实验前后比较差异无统计学意义(p&0.05);血alp在(+)病毒治疗组，(-)病毒对照组，生理盐水对照组组间比较

6、有明显统计学意义(p<0.05)o2.2bmd的测定(+)病毒治疗组与(・)病毒对照组，生理盐水对照组、空白对照组比较有明显统计学意义(p&t;0.05),其他三组比较无统计学意义(p&0.05)o3讨论骨质疏松和其引起的脆性骨折，已经成为了危及人类健康及平均寿命的主要疾病之一。rankl/rank/opg系统是骨质疏松发生机制中研究最为广泛的。rankl/rank/opg轴作用机制如下：各种骨吸收的刺激因子通过3条信号传导途径诱导成骨/基质细胞膜上表达rankl分子。rankl通过与破骨细胞前体细胞膜上rank

7、直接结合,将信号传入前体细胞，刺激破骨细胞前体发育成成熟的破骨细胞，发挥骨吸收功能。opg竞争性与rankl结合，从而阻断骨吸收信号的传递抑制破骨细胞分化、成熟。rna干扰技术是指一些小的双链ma(dsrna)在细胞内dicer内切酶的识别、结合、酶切下，产生冇活性的长度为21~23nt干扰性ma(sima),与互补的冃的基因的mrna结合并使Z降解，从而达到抑制目的基因表达的作用。高坤等⑵在细胞水平研究发现rna干扰沉默rankl表达可下调成骨细胞rankl/opg比值，抑制破骨细胞的生成。在此基础上本试验将此技术应用到动物

8、活体实验中，进一步证实rnai沉默rankl基因是成功的。本实验通过rnai诱导与其同源的mrna降解这一原理，设计慢病毒介导的携带rankl的载体，实验起初制作大鼠局部骨质疏松症模型，造模之前和治疗后测大鼠血钙磷及碱性磷酸酶的值，并测股骨骨密度值。结果提示各组血清钙磷含量均