细菌的分离培养与鉴定.ppt

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1、细菌的分离培养与鉴定一培养基的制备二消毒与灭菌三细菌的接种和培养四细菌的生化反应一培养基的制备步骤：1称量药品2溶解3调节PH5过滤分装6包扎标记7灭菌二消毒灭菌法物理灭菌法：干热灭菌法：150-170℃维持1-2h；高压蒸汽灭菌法121℃（101.53kPa）15-30min；其他：过滤除菌法、紫外线灭菌法。化学灭菌法：主要使用一些化学消毒剂进行，如：75％酒精、1％的新洁尔灭等。三细菌的分离、接种与培养细菌的分离方法：稀释法、平板分区划线法。细菌的接种方法：斜面培养基接种法、液体培养基接种法、穿刺接种法、倾注平板

2、法、平板涂布法。细菌的培养方法：需氧培养法CO2培养法厌氧培养法3.1细菌的分离培养方法连续稀释法平板分区划线分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的标本如混合细菌的分离。连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养1区2区3区4区1234平板分区划线法（学生操作）注意事项划完前一区后，需重新灼烧接种环后再进行下一区的划线。相邻两区要有重叠区域。结果观察：观察各区的生长情况，并看是否有单一菌落长出；菌落的形态、颜色、大小、边缘、透明度都需记录。平皿送37℃温箱培养24小时结果(要求)两种单个菌落分

3、四区无杂菌琼脂不破℃3.2细菌的接种斜面接种法该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。液体接种法多用于一些液体生化试验管或发酵的接种。穿刺接种法此法主要用于半固体培养基、明胶及双糖管的接种。(1)斜面琼脂培养基接种法（2人一组）大肠埃希菌/枯草芽孢杆菌/葡萄球菌送培养24小时(2支/组)一组37℃温箱一组60℃温箱一组4℃冰箱用接种环挑菌后在斜面表面划折线(2)液体培养基接种法（2人一组）1.菌种(任选一种）大肠埃希菌/枯草芽孢杆菌/葡萄球菌2.接种每一菌种分别接种pH5.0/7.2/9.0的营养

4、肉汤各一支3.送37℃温箱培养24小时液体培养基沉淀生长混浊生长表面生长(3)琼脂半固体接种法（1人一份）1.菌种大肠埃希菌/枯草芽孢杆菌/葡萄球菌2.接种用接种针穿刺接种3.送37℃温箱培养24小时3.半固体培养法－观察细菌是否有动力1、3：有动力：呈云雾状2：无动力：沿穿刺线生长，并变粗四、细菌的生化反应1糖发酵试验(Fermentationofsugars)2IMViC试验靛基质产生试验（吲哚试验）甲基红试验V-P试验枸橼酸盐利用试验3硫化氢产生试验4尿素分解试验糖发酵试验不同细菌分解糖类的能力和代谢产物不同。

5、例如大肠杆菌能发酵葡萄糖和乳糖；而痢疾杆菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖。即使两种细菌均可发酵同一糖类，其结果也不尽相同，如大肠杆菌有甲酸脱氢酶，能将葡萄糖发酵生成的甲酸进一步分解为CO2和H2，故产酸并产气；而痢疾杆菌缺乏该酶，发酵葡萄糖仅产酸不产气。吲哚（靛基质）试验(Productionofindole)有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸而产生靛基质，靛基质无色，不能直接查见，此时滴加数滴吲哚试剂于培养基的液面上，上层呈玫瑰红色者为阳性，仍呈黄色者为阴性。甲基红（methylred）试验将细菌接种于葡萄

6、糖蛋白胨水中，37℃培养48h后，再向其中加入甲基红试剂3滴。大肠杆菌等细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，但丙酮酸不被缩合成乙酰甲基甲醇，而转化成甲酸、乙酸等酸性物质，培养基中酸多，pH值低，故呈红色，为阳性。而产气杆菌将丙酮酸缩合成乙酰甲基甲醇，培养基中酸少，pH值高，故呈黄色，为阴性。VP（Voges-Proskauer）试验大肠杆菌和产气大肠杆菌均能发酵葡萄糖，产酸产气，两者不能区别。但产气杆菌能使丙酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇，后者在碱性溶液中被氧化生成二乙酰，二乙酰与含胍基化合物反应生成红色化合物，是为VP试验阳

7、性。大肠杆菌不能生成乙酰甲基甲醇，故VP试验阴性，枸橼酸盐利用试验(Utilizationofcitrate)将细菌接种于枸橼酸盐培养基上，37℃培养48h。产气杆菌等细菌能利用枸橼酸盐作为碳源，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，使培养基变为碱性，培养基中的指示剂（溴麝香草酚蓝）由淡绿色转为深蓝色，为枸橼酸盐利用试验阳性。大肠杆菌则不能分解枸橼酸盐，培养基颜色不变，为阴性。硫化氢产生试验(ProductionofH2S)将细菌穿刺接种于醋酸铅培养基中，37℃培养24h后观察结果。有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，生成硫化氢，

8、穿刺部位呈黑褐色，是为反应阳性。培养基颜色无变化，则为阴性。尿素分解试验(Splittingofurea)将细菌接种于尿素培养基中，37℃培养18～24h。变形杆菌能迅速(2～4h)分解尿素产生大量的氨，使培养基变碱而呈紫红色，是为阳性反应。实验后处理将接种针和接种环放入原位，摆放整齐！将所有的原菌种管放入自己组的红框试管架中！将自己接种的培养