噬菌体展示技术制备甲氧基有机磷农药抗独特型抗体.pdf

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1、第39卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第2期2011年2月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl78～182DoI：1o．3724／SP．J．1096．2011．00178噬菌体展示技术制备甲氧基有机磷农药抗独特型抗体贺江梁颖樊明涛刘贤金(西北农林科技大学食品科学与工程学院，杨凌712100)(江苏省食品质量安全重点实验室，农业部食品质量安全监控重点开放实验室，南京210014)摘要抗独特性抗体可用于建立针对农药等小分子物质的非竞争免疫检测模式。本研究将甲氧基

2、有机磷农药通用半抗原(S羧甲基一QD一二甲基二硫代磷酸酯，CMP)连接至琼脂糖凝胶，进而对甲氧基有机磷农药广谱特异性抗体进行纯化；以纯化抗体为固相抗原，以人源scFv抗体库(TomlinsonI+J)为抗体源，进行抗独特型抗体的筛选；利用所筛选到的抗独特型抗体建立非竞争免疫检测技术。经过鉴定，共筛选出12个阳性克隆，其中Dll和B9分别属于

3、9型和a型抗独特型抗体。利用D11和B9建立的非竞争免疫分析法对马拉硫磷的IC50为(1l3．7±34．2)g／L，检出限为10．5ktg／L。关键词抗独特型抗体；非

4、竞争免疫分析；有机磷农药；噬菌体展示技术1引言目前，广谱特异性免疫检测是农药残留检测领域的研究热点】。根据农药分子的共有结构设计合成农药通用半抗原，进而制备广谱特异性抗体，是实现农药广谱检测的有效途径之一。但以该方法制备出的广谱特异性抗体针对特定农药对象的亲和力均不及以单一农药为半抗原所制备的抗体，进而影响广谱特异性免疫检测的灵敏度口~。。。Jackson和Ekinst51的研究表明，非竞争免疫检测模式与竞争检测模式相比，在灵敏度、准确度及线性范围等方面具有优势。然而，农药小分子抗原表位的单一使其难以建立

5、起类似于夹心ELISA的非竞争免疫检测模式。Barnard等嘲于1990年提出一种针对小分子物质的非竞争免疫检测模式，并命名为“IdiometricAssay”(图1)。该模式是基于两种不同类型的抗独特型抗体(Aid或Ab2)，其中口一Aid能识别Abl上抗原结合位点以外的独特位，因而能与半抗原分子同时结合Abl而互不干扰；而fl-AId能识别初始抗体(Ab1)上的抗原结合位点，并能够与半抗原分子竞争结合Abl。此外，当fl-AId与Abl结合时，由于其空间位阻作用，能抑制a—Aid与Abl的进一步结合。

6、目前，该检测模式已成功应用于雌二醇【6~、孕激素、雌激素代谢物E3Gt、胆汁酸代谢物UDCA"／-NAG[“1及I1一脱氧皮质醇㈣等小分子物质的检测。最近，Niwa等㈣以皮质醇为检测对象，建立了基于抗独特型抗体的非竞争免疫检测技术。结果表明，该模式的检测灵敏度(检出限：90pg一248fmo1)是传统竞争模式的3倍，并具有良好的特异性，可用于尿液中皮质醇的检测。抗独特型抗体制备困难是制约其应用的瓶颈“4j，但近年来噬菌体展示技术的建立与发展为抗独特型抗体的制备开辟了一条新的途径【1。本研究拟在前期制备甲氧

7、基有机磷农药广谱特异性抗体B】的基础上，采用噬菌体展示技术制备a—Aid和Aid，并建立了非竞争免疫检测技术体系。2实验部分2．1主要试剂甲氧基有机磷农药通用半抗原(S一羧甲基一o，()I二甲基二硫代磷酸酯，CMP)和广谱特异性抗体(本实验室前期制备)；人源噬菌体抗体库TomlinsonI+J(剑桥大学蛋白质工程研究中心提供)；EAHSepharose4B，蛋白G亲和纯化柱及His6标签蛋白亲和纯化柱(GE公司)；碳三亚胺偶联剂(EDC，日本2010-04-13收稿；2010-08-26接受本文系国家自然

8、科学基金项目(No．30871658)资助E-mail：jaasliu@jaas．ac．ca第2期贺江等：噬菌体展示技术制备甲氧基有机磷农药抗独特型抗体179PeptideInstitute公司)；辣根过氧化物岐化酶(HRP)标记抗一M13抗体(Amersham公司)；HRP标记的抗His6标签抗体(Genscript公司)；HRP和四甲基联苯胺(TMB，Sigma公司)；其余试剂均为分析纯。2．2甲氧基有机磷农药通用半抗原免疫亲和柱的制备采用碳二亚胺法将实验室前期制备的甲氧基有机磷农药通用半抗原(带有羧

9、基活性基团)与EAHSepharose4B凝胶(带有氨基活性基团)进行链接。取5mLEAHSepharose4B凝胶用水(pH4．5)和0．5mol／LNaC1溶液洗涤；将10mg通用半抗原溶人5mL连接缓冲液(50％甲醇，pH4．5)；将二者混合后置冰浴中缓慢振摇反应，反应前1h内分l0次加入EDC溶液至终浓度为0．1mol／L。冰浴中反应过夜后，将温度逐渐升高至室温，总反应时间为24h。反应结束后，连接产物用0．1mol／