用于慢病毒包装的高纯度质粒 DNA 的大量制备和应用.pdf

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1、泸州医学院学报2014年第37卷第3期JournalofLuzhouMedicalCollegeVo1．37No．32014257蘩lll_用于慢病毒包装的高纯度质粒DNA的大量制备和应用方红，杨文理，何涛(泸帅1医学院：肿瘤医学研究所；基础医学院生物化学教研室；转化医学中心，四川泸州646000)摘要目的：建立简便易行、成本低廉和安全可靠的高纯度质粒大量制备方法，探讨其在分子生物学研究中的应用。方法：培养含目的质粒的菌株，运用改良后的碱裂解法大量提取质粒DNA并进行纯化，微量核酸仪测定质粒DNA的产量及纯度；采用琼脂糖凝胶电泳、限制性核酸内切酶酶切、转染哺乳动物细胞和慢病

2、毒包装，鉴定质粒DNA的质量及转染效率。结果：本质粒提取方法获得质粒DNA产量为2．5mg／L菌液，ODJOD挪：1．91；以超螺旋质粒DNA为主；限制性核酸内切酶可完全酶切；哺乳动物细胞转染效率在85％以上；可用于慢病毒包装。结论：本方法抽提质粒DNA操作简单、经济实用，可替代质粒大量提取试剂盒获得高产优质的质粒DNA，充分满足了分子生物学实验的要求。关键词质粒DNA；制备；酶切；转染；慢病毒包装中图分类号Q781文献标识码Adoi：10．3969~．issn．1000—2669．2014．03．006High-yieldpreparationofhighlypurifi

3、edplasmidDNAforlentiviruspackageFangHong，YangWenli，HeTaoInstituteforCancerMedicine．DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology；。InstituteforTranslationMedicine，LuzhouMedicalCollegeAbstractObjective：Todevelopanefficient，economicalandenvironmentalmethodforthepreparationofhighlypurifiedplasmi

4、dDNAinhighyield，andexploreitsapplicationvalueinmolecularbiologicalresearch．Methods：PlasmidDNAwasisolatedandpurifiedbyanimprovedgeneralalkalinelysismethod．ThepurifiedplasmidDNAwasquantifiedbyspectrophotometricmeasurement，andidentifiedandevaluatedbyelectrophoresisinagarosegel，digestedwithres

5、trictionendonuclease，transfectedintomammaliancellsandlentiviruspackaged．Results：ThequantityofplasmidDNApreparedbytheoptimizedmethodwas2．5mgpermillilitercultureoftransformedbacteria，andtheratioofOD260／0D280was1．91．TheplasmidDNAwasmainlycomposedofsupercoiledstructure．TheplasmidDNAcouldbefull

6、ydigestedwithrestrictionendonuclease．ThetransfectioneficiencyoftheplasmidDNAinmammaliancellswithLipofectamine2000wasbeyond85％．Conclusion：Theimprovedmethodissimple。practicalandeconomica1．Itcanreplacethe“PlasmidMaxiPreparationKits’’methodtopreparesufficientplasmidDNAtomeettheneedsofmolecular

7、biologicalresarches．KeywordsPlasmid；Preparation；Restrictionendonucleasedigestion；Transfection；Lentiviruspackage质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单效率及纯度对后续步骤至关重要。近期有关提高质位，是可以把外源基因导人细菌进行扩增和表达的粒DNA产量及纯化的方法可见报道{。常见的质粒载体，是基因工程的主要工具。现代生物学实验中DNA大量提取方法主要有SDS碱裂解法、碱裂解结经常需要大量制备高质量的质粒，质粒