质粒dna的碱法大量制备,实验报告

《质粒dna的碱法大量制备,实验报告》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划质粒dna的碱法大量制备,实验报告　　SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备　　用碱和SDS处理可以从大规模的细菌培养物中分离质粒DNA，所获得的质粒则可通过柱层析或CsCl-溴化乙锭梯度离心进一步纯化：　　材料：　　缓冲液和溶液：　　碱裂解液I：　　50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-HCl　　10mmol/LEDTA　　碱裂解液II：NNaOH　　1%SDS　　碱裂解液III：5mol/L乙酸钾60ml　　冰乙酸　　双蒸水所配成的溶液中钾的浓度为

2、3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。保存于4摄氏度，用时置于冰浴中。）　　另需：　　乙醇　　异丙醇　　STE　　TE目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　溶菌酶　　现在开始实验：　　细胞的制备：　　1.挑取转化细菌的单菌落，接种到30ml含适当抗生素的培养基中。　　注：a.试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大4倍。　　b.试管不宜盖的太紧c.应在剧烈振摇下温育　　

3、2.在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚期。　　3.在含500mlLB、YT或Terrific培养液及适当抗生素的烧瓶中接种25ml对数生长期晚期的菌液，将此培养液在37摄氏度剧烈振摇培养约小　　时。　　注：最后菌液的OD600值应为。由于不同菌株的生长速度不同，可稍微延长或缩短培养时间，使最终的OD值为。　　4.若质粒为低或中拷贝数的松弛型质粒，在培养液中添加浓度为34mg/ml的氯霉素，使其终浓度为170微克/ml。注：对于高拷贝数的质粒不需要添加氯霉素。　　5.于37摄氏度，以300r/min剧烈振荡再培养12~16h。　　6.取部分菌液到离心管中，4摄氏度

4、储存。于4摄氏度，以2700g离心15min以收集余下的近500ml培养物。弃上清，倒置离心管使残余的上清流出。目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　7.用200ml冰预冷的STE重悬细菌沉淀，按步骤6所述重新收集细菌并贮存于零下20摄氏度。　　8.用步骤6中贮存的1~2ml菌液提取质粒，采用酶切和琼脂糖电泳分析此小量制备质粒，以确定大量培养菌液中正确的质粒已得到扩增。　

5、　注：设置这种对照可能看上去有点过于谨慎，然而它可以避免发生某些可能难以挽回、浪费大量时间的错误。　　9、将步骤7中冻存的细菌在室温下放置5~10min使其解冻后，用18ml碱裂解液I重悬。　　注：只有步骤4中使用了氯霉素的菌液才应参照括号中的体积数。　　10、加2ml新配置的10mg/ml溶菌酶。　　11、加40ml新配置的碱裂解液II。盖上离心管盖，轻轻颠倒数次，彻底混匀，室温下放置5~10min。　　注：延长超螺旋DNA暴露于碱的时间会使其不可逆变性，所产生的环状卷曲DNA不能被限制酶内切，而且它在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率为正常超螺旋DNA的两倍，难以被溴化乙锭染色

6、。从细菌中用碱裂解法提取质粒时可能会看到微量的这种DNA。　　12.加20ml冰预冷的碱裂解液III。盖上离心管盖，轻轻地但完全地振荡混匀几次。将离心管在冰上放置10min。目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　注：在放置过程中会出现由染色体DNA、高分子量RNA、钾离子/SDS/蛋白质/细胞壁复合物一起形成的乳白色沉淀。在碱裂解液III中最好使用醋酸钾而非醋酸钠，因为十

7、二烷基硫酸钾盐远比钠盐难溶。　　13.在4摄氏度20，000g离心碱裂解液30min，无须制动，让转头自然停止。将上清轻轻移入量筒中，弃去离心管中的沉淀。　　注：不能形成紧密沉淀的原因常常是加入裂解液II时混匀不充分。如果细菌碎片不能形成紧密的沉淀，以20,000g再次离心15min，然后将上清尽量移入干净的离心管中。转移的时候使用四层纱布过滤上清可以除去黏稠的基因组DNA和蛋白质沉淀残余。　　质粒DNA的回收：　　14.量取上清的体积，将其连同倍体积的异丙醇一起移入一只洁净离心管中并将其充分混匀，室温下放置10min。　　1