临床医学毕业论文基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱与电喷雾离子化四极杆飞行时间.doc

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1、XX大学毕业论文iii基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱与电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱分析蛋白质姓名：2014年6月25日基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱与电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱分析蛋白质作者：倪国新朱镭马小土徐学敏胡晓芳刘建华李伟【摘要】为比较基质辅助激光解析电离串联飞行吋间质谱(MALDITOFTOF)和电喷雾离子化四极杆飞行吋间质谱(ESIQTOF)在蛋白质定性和定量分析方面的性能，分别利用两种仪器对用于和对和绝对定量的等量异位标签(iTRAQ)标记的雌激素刺激前后MCF7细胞内的蛋口质水解产生的多

2、肽进行了定性和定量分析。结果表明，用MALDITOFTOF和ESIQTOF方法分别鉴定出1086种和848种蛋白质,其屮相同的蛋白质为633种;MALDITOFTOF和ESIQTOF方法分别找到38种和33种表达差异在0.5倍以上的蛋白质，其屮3种为相同的蛋白质。实验数据说明，两种仪器在蛋白质定性和定量分析方而有很大的互补性，将两种仪器结合使用，不仅能够显著提高蛋白质定性和定量分析的覆盖率，而口可提高分析的置信度。【关键词】等量异位标签，基质辅助激光解析电离申联飞行吋间质谱，电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱，定性分析，定量

3、分析1引言基质辅助的激光解析电离(MALDI)和电喷雾电离(ESI)是FI前用于多肽和蛋白质电离的两种主要方法。这两种方法在多肽离子化方面具有很大的互补性[l]o研究表明，MALDI有利于碱性氨基酸残基的离子化[2],ESI有利于疏水氨基酸残基的离子化[3]。ESI源由于可与液相色谱分离的洗脱物在线连接，因此已成为蛋白质组学分析屮广泛采用的离子化方式。但这种分析流程受到质谱分析的循环吋间限制。近年来，LCMALDI技术的推广显著扩展了MALDITOFTOF在高通量蛋白质组学研究屮的应用范围。由于多肽洗脱峰是离线收集的，因

4、此不受质谱分析循环时间的限制。现阶段蛋口质组学定性和定量研究主要采用“鸟枪法"(Shotgim)进行，保证定性和定量的特异性的同吋提高蛋白质鉴定的覆盖率，是一个迫切需要解决的问题。定量蛋口质组学是功能蛋口质组学研究的重要组成部分。稳定性同位素标记结合在线或离线的液相色谱(LC)串联质谱(MS/MS)分析是H前定量蛋白质组学研究所采用的主要技术路线之一。常见的稳定性同位索标记方法包括SILAC(Stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture)体内代谢标记[4]、ICAT(Tso

5、topecodedaffinitytags)[5]>iTRAQ(Tsobarictagsforrelativeandabsolutequantification)[6]>体外化学标记及180稳定性同位素标记[7,8]。SILAC只适合细胞培养条件下进行氨基酸掺入标记，ICAT方法只能用于含有半胱氨酸的多肽标记和两组样品间的比较。iTRAQ可高效率标记赖氨酸残基和N末端的氨基,能同吋进行4〜8种样品的比较分析，而且适用于所有来源的蛋白质样品，因此在进行多个样品分析吋具有明显优势oMALDTTOFTOF和ESIQTOF是iT

6、RAQ标记样品分析屮常用的仪器，这两种仪器不仅采用不同的离子源，血且质量分析器构成也不同。前者的质量分析器是由两个飞行时间(Timeofflight,TOF)分析器组成，后者的质量分析器则由一个四极杆和一个TOF质量分析器组成。已有研究者对上述两种仪器在大肠杆菌DNA结合蛋白质鉴定上的性能进行过比较[9],但至今未见有关两种类型仪器在复杂蛋白质混合物定量分析丄的性能比较报道。为了比较这两种仪器在iTRAQ标记样品分析屮的性能，本实验设计利用iTRAQ标记的雌二醇刺激前后的MCF7细胞内蛋白质來评估MALDITOFTOF和

7、ESIQTOF的分析性能。2实验部分2」仪器与试剂HP1200毛细管液相色谱系统(美国Agilent公司);QStarXLMS/MS系统、TempoNanoLC分离点靶系统和4800MALDITOFTOF蛋白质分析仪（美国AppliedBiosystems公司）。雌激素受体阳性（ER+）的人乳腺癌细胞株MCF7（上海市肿瘤所）;RPMI1640培养基干粉、胎牛血清和胰蛋白酶（美国Gibco公司）;17卩雌二醇（17卩oestradiol,E2,美国Sigma公司）;蛋口浓度测定试剂DeProteinAssay（美国Bio

8、Rad公司）;iTRAQReagentMultiPlexKit（美国AppliedBiosystems公司）;HPLC级超纯水和乙月青（美国Merk公司）淇它试剂均为色谱纯。2.2实验方法2.2.1细胞培养与蛋白质抽提MCF7细胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液在含5%CO2的37°C孵箱屮培养，用2.5