滤纸酶活力测定方法.doc

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1、滤纸酶活力测定方法1试剂(1)1M柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸（C6H8O7·H2O）210g，加蒸馏水750mL，再加氢氧化钠78g，充分溶解并冷却后测pH值约为4.2，最后补水定容至1000mL，得到1mol/L的柠檬酸缓冲液，其pH值约为4.45。(2)0.05M柠檬酸缓冲液：将1M的柠檬酸缓冲液稀释20倍即可。量取1M的柠檬酸缓冲液50mL，加水定容至1000mL，得到0.05mol/L的柠檬酸缓冲液，其pH值为4.8。(3)10mg/mL标准葡萄糖母液（pH4.8）：精确称量1.000g无水葡萄糖（分析纯），或1.1009g一水合葡萄糖（分析纯），用0.05M

2、的柠檬缓冲溶液（pH4.8）定容至100mL。得到10mg/mL、pH4.8的标准葡萄糖溶液，分装小试剂瓶，置于–20℃冰冻保存。用时按一定比例稀释成不同的浓度系列。2葡萄糖标准曲线(1)将10mg/mL的标准葡萄糖溶液用0.05M的柠檬酸缓冲液稀释成一系列浓度梯度的糖液，分别为：0.20、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60mg/mL。(2)上述不同浓度的糖液各取1.5mL，置于已编号的10mL具塞刻度试管中，空白对照为1.5mL的0.05M的柠檬酸缓冲液。(3)每管中均加入2mLDNS试剂并混匀，在沸水浴中保温5min（注意：水沸腾时开始计

3、时），迅速冷却，加水稀释至10mL并充分摇匀。(4)利用分光光度仪在540nm波长下测定各管的吸光值，用空白管调零点。(5)以吸光值为横坐标，葡萄糖含量（mg）为纵坐标，绘制标准曲线，并拟合回归方程：Y=A+B*X。3测定步骤(1)在10mL具塞刻度试管中，放入50mg的WhatmanNo.1滤纸条（1×6cm），注意要先将滤纸条卷起并折叠。(2)将待测定的酶液适当稀释，用微量进样器精确吸取50ml，小心地置于滤纸卷上；再加入1.45mL的柠檬酸缓冲液（0.05M，pH4.8），将滤纸条充分浸没。整个反应体系的总体积为1.5mL。(3)盖紧塞子，在往复式水浴恒温振荡

4、器中，于50℃、80次/分的条件下反应30min（预热3min）。(4)立即往刻度试管中加入2mL的DNS试剂，在沸水中保温5min（水沸时开始计时），冷却后加水稀释至10mL，充分摇匀。(1)空白对照用50ml已灭活的酶液代替，其余步骤同前。或者先不加酶液，加完DNS并煮沸后再加入50ml酶液，稀释至10mL后作为空白对照。(2)用空白调零，在540nm下测定样液的吸光值，根据回归方程得出葡萄糖含量，并计算滤纸酶活力。(3)一个滤纸酶活力国际单位（FPIU）定义为：酶水解反应中每分钟生成1.0mmol葡萄糖（以还原糖表示）的酶量。按下式计算：