细胞培养中的细节问题.ppt

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1、基础篇-实验用品细胞培养中的细节问题1.清洗︰1.1.新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05NHCl浸泡数小时，洗净后才开始使用。1.2.用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。2.灭菌︰2.1.实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃,20分钟，置于oven中烘干。2.2.实验用玻璃pasteurpipet以干热灭菌170℃,4小时。2.3.液体或是固体废弃物可用10%hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水)或是蒸汽高压灭菌121℃,20分钟处理。基础篇-

2、抗生素1.细胞库之细胞培养基不加抗生素1.1.培养自ATCC引进之细胞株，培养基中不加抗生素。1.2.培养自其它实验室引进之细胞株，制作tokenfreeze前培养基须添加抗生素，待tokenfreeze通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。2.寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask时，则须添加抗生素(penicillin100units/ml+streptomycin100ug/ml)。3.若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin会抑制mycoplasma生长。4.

3、去除细菌污染之抗生素混合配方:penicillin250units/ml,streptomycin250ug/ml,neomycin250ug/ml,bacitracin2.5units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。5.抗生素使用种类与浓度：              工作浓度.储存温度杀灭细菌penicillin100units/ml-20℃G(+)bacteriastreptomycin100ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteriachlotetracycline50ug/ml-20℃G(+)

4、andG(-)bacteriagentamicin50ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria,mycoplasmaamphotericinB2.5ug/ml-20℃yeastandmoldsnystatin50ug/ml-20℃yeastandmoldsfungizone2.5ug/ml-20℃yeastandmolds基础篇-血清1.血清必须贮存于–20～-70℃，若存放于4℃，勿超过一个月。2.血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。3.瓶装(5

5、00ml)血清解冻步骤(逐步解冻法):-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装40～45ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。4.heat-inactivation是指56℃,30分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质

6、。5.勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。6.血清之沉淀物6.1.凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin)造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。6.2.显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境

7、下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。基础篇-细胞传代培养1.细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3至1:6，依细胞种类而异。2.附着型胞(adherentcell)2.1.吸掉旧培养液。2.2.加入trypsin-EDTA溶液，37℃作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶液，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中

8、，以正常培养条件培养。2.2.悬浮型细胞(suspensioncell)2.2.1.吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000rpm5分钟。2.2.2.吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。2.3.融合瘤(hybridoma)2.3