细胞培养中的细节问题

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1、细胞培养中的细节问题基础篇-无菌操作基本技术1.实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放臵，其它实验用品用完即应移出

2、，以利于气流之流通。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放臵桌面。4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少ClassII)。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免

3、尖锐针头之伤害等。5.定期检测下列项目：5.1.CO2钢瓶之CO2压力5.2.CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。5.3.无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。6.水槽可添加消毒剂(Zephrin1:750)，定期更换水槽的水。基础篇-实验用品1.种类︰1.1.细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteurpipet外，其它均为塑料无菌制品。1.2.TC级培养盘表面均有coating高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask

4、，plates,dishes,rollerbottle等，依实验需要使用。1.3.plasticsterilepipet:1ml,2ml,5ml,10ml,25ml1.4.塑料离心管:15ml,50ml，均有2种不同材质，其中polypropylene(PP)为不透明材质，polystyrene(PS)为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。1.5.glasspastuerpipet:9inch，用以抽掉废弃培养液等。1.6.玻璃血清瓶(PyrexorDuranglassware)：100ml,250ml,500ml,1000ml2.清洗︰2.1.新购玻璃血清瓶

5、先以0.1~0.05NHCl浸泡数小时，洗净后才开始使用。2.2.用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。3.灭菌︰3.1.实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃,15lb,20分钟，臵于oven中烘干。3.2.实验用玻璃pasteurpipet以干热灭菌170℃,4小时。3.3.液体或是固体废弃物可用10%hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水)或是蒸汽高压灭菌121℃,15lb,20分钟处理。基础篇-培养基1.液体培养基贮存于4℃冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃水槽中温热。2.液体培养

6、基(加血清)存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。3.粉末培养基配制(以1升为例)：3.1.细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基之配制体积为900ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。3.2.材料：纯水(milli-Q水或二次至三次蒸馏

7、水，水品质非常重要)，粉末培养基，NaHCO3，电磁搅拌器无菌血清瓶，0.1或0.2mm无菌过滤膜，pH计，真空泵，CO2气体3.3.步骤：3.3.1.取粉末培养基溶于700mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解。3.3.2.称取适量之NaHCO3粉末溶于200mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2气体至饱和，约3-5分钟。3.3.3.将溶解且含饱和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH应为7.2-7.4，除非pH值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2气体调整pH