质谱定量的原则系列讲座.doc

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1、质谱定量的原则系列讲座（转自分析测试百科叮当空间）质谱定量的原则01--目录：1．质谱定量的简介a)总离子流b)选择离子监测（SIM）c)选择反应监测（SRM/MRM）2．开发一个SRM方法3．内标4．PK/LC/MS/MS药物代谢动力学的LC/MS/MS的反相液相色谱的方法开发5．样品制备6．标准和标准曲线的准备a)做标准曲线的步骤b)标准曲线的稀释方案Scheme的举例c)标准曲线的运行d)进行标准品和样品的随机化e)系统运行的实用性f)“QCs”质量控制7．相关的PK资源8．定量的技巧Tips质谱定量的原则02——质谱定量

2、的简介和LC/MS监测的模式简介本教程主要用于：使用质谱作小分子药代动力学分析，即PK/MS。除此之外，这些同样的原则也可用于生物基质中肽和蛋白的定量。传统上，在使用现代质谱定量之前，定量是用HPLC高效液相色谱和UV紫外检测器实现的。HPLC药代动力学分析建立在保留时间、峰面积和紫外光谱性质的基础上的。HPLC方法的缺点是灵敏度不够、缺乏特异性。我们已经看到一些实例，一个化合物的确已经代谢了，然而保留时间和紫外光谱上，母离子和代谢物无法区分。这种缺少特异性的分析时不时会误导研究者。所以在药代动力学分析中，基于质谱的表征现在是一

3、种新型的重要的工具。质谱定量中已经被广泛接受的方式是MS/MS定量。这种定量常通过三级四极杆或离子阱质谱实现。要求使用MS/MS的原因是：许多化合物有同样的质量。当使用第一个维度即单级质谱MS去定量时，也会缺乏特异性，尤其是对于像血液那样的复杂的基质。第二个维度的MS（即MS/MS）在大多数情况下，能够提供唯一的断裂。合并特异的母离子质量和唯一的碎片离子信息，可以选择性地监测被定量的化合物。下面我们将讨论获得和可视化LC/MS数据的方法。获得和可视化LC/MS的数据，或称为：质谱数据如何在一个LC/MS实验中表达？典型的方法，质

4、谱被设置为扫描特定的质量范围。在全扫描分析中，质量扫描范围较宽；在选择离子监测SIM时，质量扫描范围较窄。依赖于扫描的类型，一个独立的质量扫描时间可以从10ms到5秒。在一次LC/MS分析中可获得许多个扫描。LC/MS数据的表示方法为：把每个质量扫描的离子流信息叠加，画出随时间变化的总离子流，横轴是时间，纵轴是强度。总离子流图非常像HPLC的紫外图，见图1。。下面我们将讨论各种扫描的模式，和这些模式同质谱定量的关系。最常见的LC/MS数据模式为：（1）总离子流图（2）选择离子监测（SIM）（3）选择反应监测（SRM）或多反应监测

5、（MRM）：MRM和SRM本质上是同样的实验模式。全扫描分析图1从药代分析中得到的全质量范围的总离子流图（TIC）非常像HPLCUV图，除了：质谱能检测到更多的化合物，尤其是没有紫外吸收的化合物。总离子流是一个叠加图，叠加了每个质量扫描的离子流。当一个小分子或小肽流出HPLC色谱柱时，相对强度上升，在TIC图上出现了一个峰，横轴是时间。每个质量的化合物都被记录在TIC图上。找出感兴趣的化合物可能是困难的，因为许多化合物有相同的质量。化合物的天然质量不是鉴定的唯一性数据。设置一个确定的质量，可以画出一个提取离子流图，但这个图的强度

6、会比下面介绍的SIM实验中的强度低。（注意：TIC指的是在一段时间内采集的质量扫描数据，不特指扫描范围或质谱实验的类型。例如，我们可以在SIM或SRM实验中获得TIC图。然而，为简单起见，我们将把这些图称为SIM和SRM图，而不是SIMTIC图。）SelectedIonMonitoring选择离子监测在选择离子监测中，质谱被设置为扫描一个非常小的质量范围，典型的是一个质量数的宽度。选择的质量宽度越窄，SIM的确定度越高。SIM图就是从非常窄的质量范围中得到的离子流图。只有被该质量范围选择的化合物才会被画在SIM图中。图1和图2是

7、同一个样品的谱图，然而它们看起来很不相同。原因是在SIM图中，画的是TIC图中较少的组分。SIM图是比TIC图更确定的图。图2然而，SIM图仍显示了许多峰，不能唯一地确认我们感兴趣的化合物。一个复杂的样品（比如血清或血浆）中，这样的图是一个典型的SIM图。许多化合物有同样的质量，在ESI中还有多电荷峰也和我们感兴趣的化合物有同样的m/z值。SIM实验比全扫描实验更灵敏，因为质谱在一个更小的质量范围上驻留（dwell）更长的时间。SelectedReactionMonitoring选择反应监测（SRM）SRM被大多数科学家在质谱定

8、量中使用，见图3。SRM中，可以监测一个特征的唯一的碎片离子，在很多非常复杂的基质中进行定量。SRM图非常简单，通常只包含一个峰。这种特征性使SRM图成为灵敏度高且特异性强的理想的定量工具。图3SRM的过程：选择一个特征的母离子做MS/MS，在其碎片中选择一个特