荧光PCR系列产品操作培训.ppt

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1、荧光PCR系列产品操作培训一、实时荧光PCR平台简介二、荧光PCR系列产品操作细节三、荧光PCR异常结果分析一、实时荧光PCR平台简介传统PCR&实时荧光PCR实时荧光PCR常用荧光标记荧光染料SYBRGreenISyto9荧光探针TaqManTaqMan-MGBTaqMan水解探针作用机理探针与目标序列配对光能量转移Taq游离的探针，无荧光。荧光基团荧光淬灭基团延伸时，Taq酶水解探针，使报告基团和淬灭基团分离而发出荧光，形成荧光信号。Taq发出荧光光实时荧光PCR实验原理采用特异性引物，结合特异性的TaqMan荧

2、光标记探针技术，通过荧光PCR仪，进行同步核酸扩增与检测。扩增曲线四个阶段基线阈值Ct值【DNA】0基线：扩增曲线的水平部分基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的默认前15个循环信号作为荧光本底信号对数图谱线性图谱基线阈值Ct值【DNA】0默认阈值=基线（背景）信号标准偏差×10缺省设置：3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值（进入指数期的最初阶段）基线阈值Ct值【DNA】0Ct值：每个样本荧光信号到达设定域值时所经历的循环数基线阈值Ct值【DNA】0每个样

3、本的Ct值与该样本的起始拷贝数（【DNA】0）的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。起点定量&终点定量起始DNA量：样本中原有的量，更有意义；终点DNA量：经PCR过程加工，不是研究所需要的数据；起点定量误差小，终点定量误差大。二、荧光PCR系列产品操作细节HPV系列产品13种高危型HPV检测试剂盒（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68）不分型14种高危型HPV检测试剂盒（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）

4、对HPV16、18分型样本类型&采集方法宫颈脱落细胞用棉试子擦去宫颈口的分泌物，取宫颈环状上皮与柱状上皮转化处宫颈脱落细胞。男性尿道标本用细小棉拭子伸入尿道约2-4厘米，捻动拭子采集上皮细胞，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检（采集标本前2小时禁小便）。男女性疣体标本既可以直接切下疣体组织放进无菌玻璃管内，又可以用一次性注射器把疣体刺破后再用棉拭子反复擦拭病灶处脱落细胞置入无菌玻璃管，密闭送检。特殊样本TCT采集系统样本：可以使用，但可根据所剩细胞浓度竞品采样系统样本：亚能、港龙等采样系统样本均可用，HC2采样系统要确

5、保未经过处理方可使用采样前注意事项不可在碘试验和醋酸试验之后采集样本。（可能会抑制PCR反应）检查前48小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物。（可能会造成假阴性）（可能会抑制PCR反应）检查前48小时不应有性生活。（可能会造成假阳性）月经期不可采集标本。（防止血液过多，可能会抑制PCR反应）注意避免交叉污染。（可能会造成假阳性）样本保存样本采集后，如若不能马上检测，应将样本置于冰箱4℃存放，并在一周时间内检测。应避免反复冻融。一周后检测的标本应保存在-20℃。DNA提取取800ul样本离心得沉淀↓加入细

6、胞裂解液50ul，煮沸10min↓12000离心10min即可上机若肉眼未见沉淀，可增加取样量，再次离心收集沉淀；若沉淀杂质较多，可用细胞保存液洗涤1-2次；血液多样本，用蒸馏水洗涤1-2次；粘液多样本，取样时尽量去除粘液。应注意防止爆盖：金属浴可压重物（冰盒、冰袋等）水浴应采用螺旋管盖的离心管确保离心管质量合格优点：简单、快捷、方便。缺点：HPVDNA纯度较差，含有血红素、蛋白、脂类等PCR抑制剂。针对男性样本或女性疣体样本（棉拭子样本），先用细胞保存液/生理盐水洗脱，收集沉淀，而后与上述操作一致DNA质量要求匹基

7、、达安等都是使用直接煮沸法提取的DNA，可直接使用使用过柱法试剂盒，比如QIAGENE提取的DNA，也可以使用PCR试剂配制按样本数加入所需溶液的对应量，充分混匀再分装对照设置定性试验每次试验都必须设置阴阳性对照定量试验个别医院要求定量结果，需增加标准品（105、106、107、108copies）标准品一般可以反复冻融3-4次，超过5次，则不建议使用标准品置于-20℃中保存操作注意事项PCR试剂保存配制PCR试剂应放于-20℃避光保存PCR试剂应避免反复冻融试剂配制时不能佩戴有粉手套PCRmix与Taq酶充分混匀加

8、模板时应避免吸到沉淀漂浮的杂质常粘附于管壁，中间吸样较安全切勿在PCR管上做标记，但应注意样本顺序上机前应离心去除气泡标准品加样时应尽量避免加样误差，影响标准曲线仪器检测通道选择STD系列产品CT/NG/UU联合检测试剂盒淋球菌核酸检测试剂盒沙眼衣原体核酸检测试剂盒解脲脲原体核酸检测试剂盒样本类型&采集方法宫颈脱落细胞用棉试子擦去宫颈口的分泌物