RealtimePCR检测原理和问题处理.ppt

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1、Real-timePCR检测技术原理和问题处理2014-06-25★实时荧光定量PCR检测技术（Real-timePCR)荧光定量PCR（Realtimefluores-cencequantitativePCR,RTFQPCR)是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种新定量实验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。★实时荧光定量PCR检测技术（Real-timePCR)定量PCR的数学原理定量PC

2、R的化学原理定量PCR的光学原理什么是PCR？PCR的反应过程RT-PCR原理图荧光定量PCR的数学原理1、Baseline(基线)2、Threshold(阈值)3、ThresholdCycle(CT值)4、[DNA]0(初始模板)Threshold(阈值)[DNA]0(初始模板)ThresholdCycle(CT值)Baseline基线基线反应荧光明显增加前的背景荧光值。默认为3-15cycles的信号值线性图谱对数图谱阈值阈值=基线（背景）信号的标准偏差的10倍，即PCR扩增信号进入相对稳定对数增长的最下限，通常设定在S型扩增曲线的增长拐点

3、处附近。Ct值扩增反应中，当荧光信号增长到大于阈值时所对应的循环数，即PCR增长信号与Threshold发生交汇的循环数，也是FQ-PCR判断阴阳性和进行定量分析的依据。[DNA]0确定初始模板的浓度初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量Real-timePCR动力学曲线和四个阶段只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。PCR理论方程只在指数期成立。PCR产物的量与

4、扩增循环数间的理论方程Rn=RB+X0(1+e)nRsRn:第N次PCR循环时的荧光信号强度RB:背景信号强度X0(1+e)nRs:每个分子的荧光强度与分子数目的乘积经过一系列移项、取对数等复杂数学公式变换：得到：Ct=klgX0+b线性方程，lgX0越大，则CT值越小！从荧光信号实现定量结果一、检测荧光信号增长，获取样品CT值从荧光信号实现定量结果二、绘制标准曲线从荧光信号实现定量结果三、以待测样品的Ct值对[DNA]0作图，得到定量结果定量PCR的数学原理定量PCR的化学原理定量PCR的光学原理常用的荧光标记方法1、DNA双链特异性染料S

5、YBRGreen、SYTO9、LCGreen、Evagreen2、序列特异性探针TaqMan、MolecularBeacons（分子信标）、DualProbes(FRET)、LNA(LockedNucleicAcid)Double-DyeprobesSYBRGreenI工作原理1、每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去2、染料一结合，就产生荧光信号3、信号强度与DNA分子总数目成正比SYBRGreenI工作原理图片演示熔解曲线(Dissociationcurve)目的：在PCR之后分析产物特异性基本程序：-解链；-复性；-升温检测；-

6、降温；软件自动分析融解曲线(Dissociationcurve)PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。Tm值：50%DNA变成单链时所需要的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有关，可部分代表产物序列的特异性；PCR反应完成后，控制体系温度缓慢升高，双链DNA解链成为单链DNA，SYBRGreen被释放，荧光信号逐渐减弱；当体系到达某一特定温度时，某些DNA双链会突然完全解离，荧光强度也显著减弱；对融解曲线求一阶导数，峰值代表斜率改变最大值，该处所对应的横坐标值（温度），即Tm融解曲线(Dissociation

7、curve)PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。原始图谱导数图谱只有染料法才需要做熔解曲线，探针法没必要。SYBRGreenI的优缺点成本低不需要制备序列特异的针对性探针，且试剂便宜适合初步筛查先用SYBR筛查，再对少数关键样品用探针法确认配合熔解曲线分析需鉴定PCR反应是否有杂带、引物二聚体特异性问题不能分辨主带与杂带，给出所有双链DNA的总信号多重定量问题每个PCR管只能检测一个目标基因Taqman原理Taqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为基础，Taqman荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基

8、团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧