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《试论盐芥miRNA393沉默载体构建.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、试论盐芥miRNA393沉默载体构建摘要将与内源mRNA编码区同源的小片段外源双链RNA导入细胞中，通过一系列细胞内反应引发细胞中相应mRNA降解,可导致特定基因表达沉默。通过PCR扩出与miRNA399互补的IPS,并改造成与miRNA393互补的IPS；测序正确后酶切连入3301H载体转化盐芥。关键词盐芥;miRNA393;沉默载体;构建中图分类号Q752文献标识码A文章编号1007-5739(2010)23-0011-01ConstructionofmiRNA393SilencedVector
2、inThellungiellasalsugineaCHENLong-junHOULEiJIHong-fEI(CollegeofLifeScience,ShandongNormalUniversity,JinanShandong250014)AbstractWhenguidessmallexogenousdsRNAstocellsthatarehomologictotheirendogenesisRNA'sproteincodingregion,theycanleadspecificgenetosil
3、encebyseriesofreactionswhichbringin-cellzscorrespondingmRNAtodegrade・ThegeneIPSwhichcomplementarytomiRNA399sequencewasfirstlyreceivedanditwasreconstructedtoIPS'thatcontainsaregioncomplementarytomiRNA393・Aftermakingsurethesequceright,theyconnectedtheaid
4、genewiththe3301Hemptyvector.KeywordsThellungiellasalsuginea;miRNA393;silentvector;construction作为一种小RNA,miRNA很难得到它的缺失突变体。因为每个miRNA家族中有多个成员，各成员核昔酸序列相似,仅把其中一个沉默，并不影响靶基因的剪切，不会出现预期表型。为miRNA研究带来一定困难。2007年,Jose'ManuelFranco-Zorrillal等在研究低磷诱导的miR399时，发现了一个非编码的
5、IPS1JPS1具有短的不保守的开放读码框,有编码四肽(Met-Ala-lle-Pro)的潜能［1-2］o并且具有一个23bp的基序，该基序是保守的,并且其能够与miR399互补配对。然而这种互补配对并不完美，而是存在一个关键错配，在miRNA的10-11座位形成1个突起的环。而这个区域的序列互补恰恰对于miRNA指导的mRNA的剪切十分重要［3・4］,为获得miRNA沉默突变体带来了方便。目标模拟［5・6］为人们提供了一种新的策略来抑制特异miRNA的活性。1材料与方法1.1试验材料供试材料:盐芥
6、(T.halophila)。供试菌株:大肠杆菌(E.coli)菌株为DH5a;农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株为GV1301菌株。载体:pMD18-T,3301Ho1.2试验方法1.2.1制备目的基因。用IPS仁57IPS13从盐芥中扩出IPS序列。用IPS1-5z-2/IPS1-3,以IPS为模板PCR扩增出IPS3'端。用改造的IPS-393-37IPS1-57以IPS为模板PCR出IPS5'端。3’端/5‘端用Hindlll酶切连接。以改造的IPS393为模板用I
7、PS仁57IPS仁3’为引物进行扩增。1.2.2连接转化。将PCR产物电泳分离，用GeneClean法回收。回收产物与T载体连接。挑DH5a单菌落于LB液体培养基中,37°C振荡培养12h;取500pL加入50mLLB中,培养至OD600=0.5;菌液冰浴30min;4°C.5000r/min离心10min;弃上清，加入8mL预冷的无0.1moL/LCaCI2溶液重悬;4°C、5000r/min离心5min,弃上清;用1mL预冷的0.1moL/LCaCI2重悬,200pL/份分装，加入适量连接产物混
8、匀，冰浴30min;429处理90s,冰浴2min;加入1mL的LB,于37°C振荡1h;涂板37°C过夜培养。123提质粒。挑单菌落于3mLLB中,379过夜。收集菌体5000r/min离心1min,重复1次。弃上清，加入200pLSolutionl重悬;加入300jjLSolutionll,混匀;加入300pLSolutionlll,混匀;加等体积氯仿混勻于11000r/min离心10min,取上清加等体积异丙醇,・20°C沉淀30min;13000r/min离心
