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1、胰岛移植物质量鉴定方法的研究摘要胰岛移植物的质量直接影响胰岛移植的效果，用经胶原酶消化、Ficoll纯化的成年大鼠胰岛，比较乙醇和二甲亚M(DMSO)配制的双硫腺(DTZ),作B细胞鉴别染色；丫噪橙(A0)-碘丙噪(PT)和双醋酸荧光索(FDA)-澳乙锭(EB)双色荧光染色，鉴别活细胞。结果表明，乙醇配制的DTZ染色对细胞毒性小，且染液易储存；A0-P1染色，因A0能识别凋亡细胞，月.着色鲜明，荧光持久。采用DTZ和AO-PI联合染色，能对胰岛的纯度、数量和活率作出精确的鉴定。关键词胰岛质量双硫腺丫噪橙碘内•噪Methodsforev
2、aluationoftheisletgraftqualityDongWeiping,ZhangHongde,WangYufei,etal.DiabetesResearchLaboratory,ShanghaiFirstPeople'sHospital,Shanghai200080AbstractTheidentificationofbetacellandlivingcellsofpurifiedisletsofadultratswerecomparativelystudiedwithethanolorDMSOprepareddithi
3、zone(DTZ)andwithacridineorange(AO)-propidiumiodide(PI)orfluorescentdiacetate(FDA)-ethidiumbromide(EB)respectively.Theresultsindicatedthatthefunctionandviabilityofisletcellswerenotinfluencedbythestaining,theinsulincontentoftheculturemediumandtheinsulinreleasetestofthesta
4、inedisletwerenotsignificantlydifferentfromthoseoftheunstainedcontrols(P>0.05).Thecel1-toxicityofethanolpreparedDTZwasmuchlessthanthatofDMSOprepared.Inaddition,theethanolpreparedDTZwaseasilypreserved.AO^PTstainingcouldidentifytheapoptoticcel1sbecausethebindingofA0withdou
5、blechainDNAshowedgreenfluorescence,whilethebindingofA0withsinglechainDNA(degeneratedDNA)showedredfluorescence.Therefore,DTZandAO-PIcombinedstainingmayexactlyidentifythepurity,amountandviabi1ityoftheislets.KeywordsIslctqualityDithizoneAcridineorangePropidiumiodide临床胰岛移植的
6、效果目前还不理想，主要由于移植物的质量与数量不足和移植物的免疫性排斥。木文报道我们近來对朕岛移植物质量鉴定方法的研究结果。材料与方法一、材料1•动物：成年SD大鼠(上海计划生育研究所提供)。2•试剂:胶原酶(V型)；双硫踪(DTZ)；丫I定橙(A0)；碘丙喘(PI)；双醋酸荧光素(FDA)；漠乙锭(EB)；二甲亚M(DMSO),以上试剂均系美国SIGMA公司产品。二、方法1•大鼠胰岛制备：成年大鼠经戊巴比妥钠麻醉，消毒，剖腹，放血处死，胆.总管原位插管，注入预温的0.5g*I「胶原酶溶液(含7.5nrnK)l*I「CQ,10mmol*
7、L'lHEPES,pH7.8)8ml,分离已膨胀的胰腺，38°C水浴振荡10分钟,取出,于冰浴中撕碎，移入消化瓶中，38°C水浴振荡5分钟，取出振摇，使呈细沙状，20目不锈钢丝网过筛，加入冰冷的Hanks液(含10%新生牛血清NCS),终止消化,4°C,1000传离心3分钟，弃上清，同法洗二次，沉淀，加25%Ficoll适量混匀,依次加入23%,20%,ll%Ficol1和Hanks液,4°C,3000转离心20分钟，吸出23%〜20%,20%〜11%界面的胰岛，经Hanks液洗三次，备用。2•胰岛DTZ染色与计数。DTZ配制方法:(
8、1)用无水乙醇配制:DTZlOmg溶于3ml无水乙醇(含50U1浓NH4OH),加Hanks液12ml,此为储存液，临用时用Hanks液(pH7.8)l:100稀释，0.22u孔径滤膜过滤，与胰岛制备物混合，室温10分钟
