白甲乌鳢种质分析、白化特征机理及其热休克蛋白基因的研究.pdf

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1、学校代码：10564学号：2013106702分类号：S937.3密级：博士学位论文白甲乌鳢种质分析、白化特征机理及其热休克蛋白基因的研究周爱国指导教师：邹记兴教授海洋学院学院名称：动物科学学院专业名称：水生生物学答辩委员会主席：秦启伟研究员中国·广州2016年6月华南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明

2、的法律结果由本人承担。作者签名：日期：学位论文提交同意书本学位论文符合国家和华南农业大学关于研究生学位论文的相关规定，达到学位授予要求，同意提交。导师签名：日期：学科带头人签名：日期：摘要本研究以珍稀的白甲乌鳢作为研究材料，利用形态学、生物学、组织学、分子生物学等方法对白甲乌鳢和乌鳢进行了比较研究，综合探讨了其分类归属、皮肤白化特征机理及其引种养殖过程中的抗应激能力等问题。1，基于形态学方法的部分鳢属鱼类系统发育关系本章运用传统形态度量法与框架法对5种鳢89个个体的11个可数和29个可量性状进行了测量。主成分分析显示所有5个主成分的累积贡献率达

3、到78.928%。主成分分析散点图显示白甲乌鳢和乌鳢重叠最大。聚类分析显示各种间可完全区分，其中白甲乌鳢和乌鳢亲缘关系最近。通过X射线摄影发现白甲乌鳢和乌鳢形态结果较为相似。由此可知，白甲乌鳢和乌鳢较为相近，无明显区别，杂交鳢也偏向于父本乌鳢。2，基于毛细管电泳的AFLP标记技术探讨部分鳢属鱼类亲缘关系本章采用AFLP-毛细管电泳技术研究了8种鳢属鱼类的系统发育关系。共筛选出10对选择性扩增引物组合，扩增总条带范围为114-206，一致性条带为0-12，多态性条带为114-196。聚类结果显示，依相似系数0.58的水平，乌鳢、白甲乌鳢、杂交鳢和

4、斑鳢聚为一支，且乌鳢和白甲乌鳢的亲缘关系最近，月鳢和带鳢聚为一支，而线鳢和小盾鳢分别单独聚为一支。该技术能有效区分鳢属鱼类的亲缘关系，为种质资源的开发利用提供一定的分子佐证材料。3.基于白甲乌鳢线粒体DNA全序列及其12sRNA、Cytb和CO1基因与D-Loop控制区序列的鳢科鱼类系统发育关系本章首先测定了白甲乌鳢线粒体DNA全基因组序列，全长16558bp，与乌鳢一致。利用MEGA6.0软件构建鳢科鱼类的遗传距离，其中白甲乌鳢和乌鳢之间的遗传距离为0.002。采用NJ、ME和ML法分别构建分子系统树，其中白甲乌鳢、乌鳢和乌斑杂交鳢单独聚为一

5、支。同时比较分析了其12srRNA、Cytb和CO1基因及其D-Loop控制区序列，白甲乌鳢和乌鳢单倍型序列之间的最大遗传距离均小于0.010，分别为0.006、0.002、0.002和0.004；分子系统树显示它们所有单倍型均单独聚为一支，且交叉排列，进一步得出白甲乌鳢应作为乌鳢白化变异种的结论。4，白甲乌鳢与乌鳢基本营养成分、皮肤黑色素含量及其组织学分析选取同一养殖水域的白甲乌鳢和乌鳢。分析肌肉基本营养成分发现白甲乌鳢较乌鳢有更高的食用营养价值，同时测定其皮肤黑色素含量显著低于乌鳢。光学显微镜观察白甲乌鳢与乌鳢鳞片和皮肤黑色素细胞在分布、密

6、度、形态、大小和生长状态等方I面存在明显差异。H&E和黑色素染色技术比较观察皮肤显微结构发现白甲乌鳢皮肤色素层趋于退化，且无明显黑色素细胞分布。利用透射电子显微镜对比分析皮肤超微结构发现白甲乌鳢皮肤黑色素细胞的黑色素体密度较小，排列混乱，呈现多种形状，真皮层的各层细胞排列不规则，无层次性。可见，黑色素细胞和黑色素沉积的缺乏、黑色素体密度较小等是导致白甲乌鳢皮肤白化现象的组织学原因。5，白甲乌鳢酪氨酸酶（TYR）基因的克隆，表达及其分子特征克隆了白甲乌鳢和乌鳢TYR基因cDNA全长，两者序列一致。同源比对发现，与硬骨鱼类相似性较高，而与细菌类相似

7、度较低。相对实时荧光定量PCR结果显示TYR基因在白甲乌鳢和乌鳢9大组织（皮肤、眼睛、肌肉、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、鳃和肠道）中均有表达。其中，白甲乌鳢眼睛组织表达量最高，而乌鳢皮肤组织的表达量最高。对比相同组织发现，乌鳢皮肤组织TYR基因表达量极显著高于白甲乌鳢（18.66倍）。细胞免疫荧光观察亚细胞定位于内质网、高尔基体、细胞质膜等部位，与预测结果一致。可见，TYR基因可能作为参与乌鳢皮肤黑色素细胞发育、分化和功能调节的重要因子，其低表达是皮肤出现白化特征的关键因素之一。6，白甲乌鳢小眼畸形相关转录因子（MITF）基因的克隆，表达及其分子特

8、征分析克隆了白甲乌鳢和乌鳢MITF基因cDNA全长，两者序列一致。同源比对发现，与硬骨鱼类相似性较高，而与昆虫类相似性较低。相对实时荧光定量PCR结果