肝糖原的提取、鉴定与定量.doc

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1、肝糖原的提取、鉴定与定量一、实验目的1.掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。2.了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蔥酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。3.熟练运用溶液混匀的各种方法(视具体情况，采用合适的混匀方法)。4.正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。5•正确掌握溶液转移的操作。6.正确操作使用分光光度计。二、实验原理(1)肝糖原的提取糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖

2、原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水,故先用95%乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。(2)肝糖原的鉴定糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，而葡萄糖具有还原性，实验可利用呈色反应和葡萄糖的还原性，从而判定肝组织中糖原的存在呈色反应具体如下：CuSOi+2NaOIl==Na2SOi+Cu(0II)2I2Cu(OH)2+GH12O6==2CuOH+氧化型葡萄糖+H202CuOH==CU2Ol(红色)+H

3、20Cu(OH)2会CuOI(黑色)+H20(3)肝糖原的定量糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物一一5-拜甲基咲喃甲醛，此化合物再与蔥酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10〜100Pg范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱屮加热，以破坏其它成分而保留肝糖原。三、材料与方法:(1)实验材料如下表

4、所示类别材料实验样品鸡肝实验试剂1)95%乙醇2)0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液3)0.15mol/LNaCl溶液4)5)12.5mol/L(50%)Na0H12mol/LHC1：浓HC1原液(36%〜38%)。6)碘试剂：碘100mg和KI200mg溶于50mL蒸憎水中(注：实验室已配好)。7)班氏试剂：称取柠檬酸钠(C5ll5Na307>51120)173g和无水碳酸钠(Na2CO3)100g溶于蒸馅水800mL中，加热促溶。冷却,慢慢倾人17.3%硫酸铜(CuS04>5H20)lOOmL,边加边摇。

5、再加蒸憾水至lOOOmL,混匀，如混浊可过滤取滤液。此试剂可长期保存(注：实验室已配好)。8)5.35mol/L(30%)K0H溶液9)标准葡萄糖液(50mg/L):称取已干燥恒重的无水葡萄糖25mg,加蒸馆水溶解至500mL（注：实验室己配好）。10)17mol/L(90%)ILS0411）蔥酮显色剂：称取蔥酮0.20g,用17mol/LH2SO4溶解至100mLo（即配即用，实验室已配好）仪器及器材1）普通离心机，室温至10CTC恒温水浴箱，722型分光光度计,2)3)托盘天平两个剪刀，镶子，研钵，lOOmL

6、容量瓶，白瓷反应板试管架，10讥离心管（2支）（注：实验中用玻璃试管代替离心管），（15X100）mm试管（6支）4)刻度吸量管（2mLXl,5mLX2）,1000uL微量可调取液器（2）实验步骤1.实验流程:肝糖原的提取与鉴定鸡肝约l.Og,剪碎1+5%CC13COOH1ml浮L状!+5%CCl3COOH3ml研磨彼肝匀浆全部转入离心管中，离心3分钟（4000r/min）I——I沉淀（弃去）上清（取2ml）+3ml95%乙醇，混匀，静置10分钟（4000r/min）上清（弃去）沉淀I+蒸锚水1ml沸水浴分钟，溶

7、解沉淀I白瓷板孔穴中糖原溶液lmlI+浓HC15滴加碘试剂2滴加碘试剂2滴评水浴15分钟，冷却+50%NaOH5滴糖原水解液2滴糖原解液J+班氏试剂4滴混匀沸水浴2分钟，观察变化糖原的定量测定鸡肝0.10gj+30%KOH1.5ml沸水浴15分钟100ml容量瓶中加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液I糖原的测定（2）实验步骤1•糖原的提取与鉴定1）称取肝脏：称取约l・0g鸡肝。2）肝匀浆准备：在研钵中将肝脏组织剪碎，加入5%三氯醋酸51,将肝组织研磨至糜状，再加入5%三氯醋酸3mlo后以4000r/min转速离心

8、5min,取上清液。3）提取糖原：于上清液中加入等量95%乙醇，混匀后静置lOmin,后以4000r/min转速离心5min,弃去上清液，白色沉淀即为糖原。加入lml蒸馆水，并加热溶解。4）糖原鉴定：取碘试剂2滴于白瓷板孔穴屮，加入糖原溶液2滴，同时另一孔穴只加碘试剂2滴，做呈色对比。5）另取糖原溶液1ml并加入浓盐酸5滴于沸水浴中水解15min后使用班氏试剂在沸水浴中加