DB23∕T 2476-2019 大豆孢囊线虫病抗性室内鉴定方法.pdf

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1、ICS65.020.20B16DB23黑龙江省地方标准DB23/2476—2019大豆孢囊线虫病抗性室内鉴定方法2019-11-20发布2019-12-19实施黑龙江省市场监督管理局发布DB23/T2476—2019前言本标准依据GB/T1.1—2009的编写规则起草。本标准由黑龙江省农业农村厅提出。本标准由黑龙江省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国科学院东北地理与农业生态研究所农业技术中心。本标准主要起草人：李春杰、王从丽、尤佳、胡岩峰、王英男、潘凤娟、黄铭慧、姜野。IDB23/T2476

2、—2019大豆孢囊线虫病抗性室内鉴定方法1范围本标准规定了大豆孢囊线虫病抗性室内鉴定方法中的试剂、材料和仪器设备、空气环境与培养条件、鉴定材料、育苗与移苗、培养、线虫接种液制备、接种、调查、抗性评价方法。本标准适用于对大豆孢囊线虫不同生理小种的抗性鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB3095环境空气质量标准GB4404.2粮食作物种子第2部分：豆类NY/T30

3、59大豆抗孢囊线虫鉴定技术规程3试剂、材料和仪器设备3.1试剂霍格兰氏（Hoagland）营养液：硝酸钙945mg/L、硝酸钾607mg/L、磷酸铵115mg/L、硫酸镁493mg/L、铁盐溶液2.5mL/L、微量元素5mL/L、pH6.0，无菌水1L，使用时稀释20倍。铁盐溶液：七水硫酸亚铁2.78g、乙二胺四乙酸二钠（EDTA.Na）3.73g、无菌蒸馏水500mL、pH5.5。微量元素液：碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/

4、L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L。3.2材料（a）植物生长袋（长17.8cm，宽16.5cm）、（b）快捞夹（长29.8cm，宽23.3cm）、（c）快捞架（长39.5cm，宽32.5cm）、（d）蛭石（20目）、（e）培养钵（高11.5cm，直径20cm）。3.3仪器设备（a）孢囊分离筛（20目、100目、200目、500目）、（b）移液器（5mL）、（c）线虫孵化池、（d）线虫计数板、（e）光学显微镜（4~40×）、（f）恒温光照培养箱、（g）高压蒸汽灭菌器（121℃、30mi

5、n）。4室内空气环境与培养条件4.1室内空气环境室内空气环境质量要求符合GB3095的规定。4.2培养条件2DB23/T2476—2019培养箱调至光周期为16h光照、8h黑暗、白天温度28℃、夜间温度22℃、相对湿度70%的循环程序。5鉴定材料鉴定材料种子质量应符合GB4404.2的规定。6育苗与移苗6.1育苗将待鉴定的种子播种在装有无菌蛭石的培养钵中，每钵40粒，常规管理。3d后种子萌发出幼苗，剔除生长不良的植株，保留生长一致的30株幼苗备用。6.2移苗（a）浸湿生长袋。向直立的生长袋内滤纸顶端夹缝

6、内加入无菌水10mL，使生长袋中的滤纸充分浸湿且生长袋底部有少量无菌水存留。（b）移苗。将30株备用幼苗转移到浸湿的滤纸顶端夹缝内，保持子叶高于生长袋上沿，每个生长袋内移入1株幼苗。（c）摆放。每2个生长袋放入1个快捞夹中，将快捞夹放到快捞架上，每个快捞架上放置30个快捞夹。7培养将整个快捞架置于培养箱中，每三天浇5mL霍格兰氏营养液和5mL无菌水。8线虫接种液制备8.1扩繁线虫经单孢囊纯化的孢囊群体接种在感病品种根部土壤中培养35d。8.2收集孢囊收集感病品种根部及土壤中的孢囊：将感病品种根和根部土壤

7、放入盛有1/3清水的1L烧杯中，用玻璃棒将泥水混合物剧烈搅拌，静置1min左右，将上清液依次倒入20目和100目的孢囊分离筛中。用高压水枪冲洗20目筛子上的感病品种根、土壤及残留物，将落入100目筛子上的孢囊冲洗至烧杯中，用置于漏斗架上的单层滤纸（直径为12.5cm）过滤。用毛笔轻轻地刷分布于滤纸边缘的孢囊，收集后即得到大量孢囊。8.3分离线虫卵将收集的孢囊转移到200目筛子上，下面套500目筛子。用橡皮塞在200目筛子上碾磨孢囊使卵释放出来，高压水枪冲洗，收集落于500目筛子上的卵。8.4线虫卵孵化将

8、线虫卵悬液加入线虫孵化池内，置于恒温培养箱（28℃，黑暗）内孵化4~5d，收集孵化出来的二龄幼虫悬浮液。3DB23/T2476—20198.5二龄幼虫接种液制备将二龄幼虫悬浮液注入线虫计数板，于光学显微镜下调查二龄幼虫浓度，不断稀释使线虫浓度调至170条/mL，并作为接种液，备用。大豆孢囊线虫不同生理小种二龄幼虫接种液制备方法相同。9接种待测植株侧根生长至5cm左右（约5~7d），从快捞夹中取出生长袋，用移液器向主根和侧根及其周围均匀滴加3