酶七章-核酸酶.ppt

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1、第七章核酶工程1981年Cech等发现四膜虫的核糖体前体RNA可以在没有蛋白质存在的情况下自身催化切除内含子，完成加工过程。该具有催化活性的RNA的发现改变了传统上“酶是蛋白质”的观念，从此对具有催化活性的RNA，即核酶(ribozyme)的结构、催化机制以及应用的研究日益深入。核酸分子在总体的催化潜力上和蛋白质相差甚远，但由于可以遗传和变异而被自然界保留下来催化一些特殊的反应。核酶由于具有许多优点而受到重视，例如用于治疗的核酶注射入体内不会产生免疫原性，对具有切割活力的核酶可以更加自由的设计其切割RNA的位点。分子进化工程的诞生，使核酶的研究迅速发

2、展，人工进化出自然界中不存在的多种功能的核酶（包括单链DNA酶），这些研究成果在理论和实际应用中都有着巨大的意义。第一节天然核酶目前为止，在自然界中发现的核酶根据其催化的反应可以分成两大类：剪切型核酶核酸酶剪接型核酶1、剪切型核酶——催化自身或者异体RNA的切割，相当于核酸内切酶。——主要包括锤头型核酶，发夹型核酶，丁型肝炎病毒(HDV)核酶，以及有蛋白质参与协助完成催化的RNaseP2、剪接型核酶——实现mRNA前体自我拼接，具有核酸内切酶和连接酶两种活性。——主要包括组I内含子和组II内含子一锤头型核酶R.Symons等在比较了一些植物类

3、病毒、抗病毒和卫星病毒RNA自身剪切规律后提出锤头结构（hammerheadstructure）状二级结构模型。它是由13个保守核苷酸残基和三个螺旋结构域构成的。——（后来Koizumi等证明只需要11个特定保守核苷酸）。锤头型核酶的二级结构和空间立体结构示意图a中N,N’代表任意核苷酸；X可以是A、U或者C,但不能是G；I、II和III是锤头结构中的双螺旋区；箭头指向切割位点。b是锤头型核酶的立体结构模型，白色链是核酶，灰色链是底物RNA分子，在磷酸骨架上结合有镁离子Symons等认为，只要具备锤头状二级结构和13个保守核苷酸，剪切反应就会在锤头结

4、构的右上方GUX序列的3’端自动发生。无论是天然的还是人工合成的锤头结构都由两部分构成：催化结构域（R）和底物结合结构域（S）。WilliamB.Lott等提出了锤头型核酶催化反应的两种可能的化学机制：——“单金属氢氧化物离子模型”——“双金属离子模型”)。锤头型核酶的两种可能的催化机制以及HDV核酶的催化机制单金属氢氧化物离子模型，(b)双金属离子模型，(c)HDV核酶中胞嘧啶充当一般碱进行催化的反应机理二发夹型核酶发夹型核酶的二级结构模型50个碱基的核酶和14个碱基的底物形成了发夹状的二级结构，包括4个螺旋和5个突环。螺旋3和4在核酶内部形成，螺

5、旋1(6碱基对)和2(4碱基对)由核酶与底物共同形成，实现了酶与底物的结合。核酶的识别顺序是(G/C/U)NGUC，其中N代表任何一种核苷酸，这个顺序位于螺旋1和2之间的底物RNA链上，切割反应发生在N和G之间。三蛋白质-RNA复合酶(RNaseP)蛋白质-RNA复合酶主要催化tRNA前体成熟过程。——例如S.Altman和N.Pace两个研究组合作发现的大肠杆菌tRNA5’成熟酶。蛋白质-RNA复合酶酶由蛋白质和M1RNA两个组分构成．——蛋白质的分子量为20kDa，——M1RNA含有377个核苷酸。M1RNA单独具有全酶活性，　　蛋白质只是维护

6、M1RNA的构　　象。实验证明来自不同原核细胞RNaseP中的M1RNA具有相似的三维结构。——与前面几种剪切型核酶不同的是，RNaseP催化得到的产物的3’端是羟基，5’端是磷酸。四　组I内含子和组II内含子组I内含子(groupIintron)和组II内含子(groupIIintron)——这类核酶比较复杂，通常包括200个以上核苷酸，主要催化mRNA前体的拼接反应。像蛋白质酶一样，内含子形成高级结构的折叠结果使关键残基形成活性部位，在辅助因子的参与下实现自身剪接。组I内含子能够自身剪接的是与它们保守的二级和三级结构有关。除了剪接之外，组Ⅰ

7、内含子还可催化各种分子间反应，包括剪切RNA和DNA、RNA聚合、核苷酰转移、模板RNA连接、氨酰基酯解等。在体外，组Ⅱ内含子的剪接是经过两个转酯化反应来实现的，无蛋白质参与。组Ⅰ和组Ⅱ内含子的主要差别是第一步反应的化学机制。在组Ⅰ内含子中，外部的鸟苷的3’-羟基作为进攻基团，而在组Ⅱ内含子中是内部腺苷的2’-羟基起作用(图7-4b)。这个反应的结果形成一个带突环的内含子-3’外显子分子，其中第一个核苷酸经由2’，5’-磷酸二酯键与内含子的A相连。在第二步反应中，5’外显子的3’-羟基进攻内含子-3’外显子连接点，结果是两个外显子相连，并释放出带有突

8、环的内含子。