番茄抗细菌斑点病基因Pto的图位克隆.ppt

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1、图位克隆的原理和步骤——以Pto基因的克隆为例图位克隆图位克隆（Map-basedcloning）又称定位克隆（positionalcloning），1986年首次由剑桥大学的Alancoulson提出。用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析目的基因与已知分子标记的连锁关系来确定目的基因在染色体上的位置。1992年拟南芥ABI3基因（Giraudatetal.,1992）和FAD3基因（Arondeletal.,1992）首先通过图位克隆的方法分离出来。图位克隆的主要步骤初步定位构建连锁图谱精细

2、定位初步定位构建连锁图谱精细定位分离群体：F2、BC1、DH等分子标记：SSR、CAPSAFLP、RFLP、RAPD等群体大小：100-200单株一般通过初步定位可以筛选出距离目的基因5-10cM的侧翼标记。初步定位构建连锁图谱精细定位整合已有的遗传图谱，将不同类型的分子标记整合到一起；对于已经测序的物种，根据目的基因附近的DNA序列设计新的分析标记；利用比较基因组的共线性，从同科属的其他生物上获得分子标记。初步定位构建连锁图谱精细定位群体大小：3000-4000株利用侧翼标记筛选出重组单株，然后用所有的多态性标记对重组单株进行分析，结合表型鉴定结果，将目的基因定位到0.5cM甚至更小的

3、范围内。物理距离≠遗传距离初步定位不同染色体区段重组值的不同会影响遗传距离的大小，因此物理图谱才是真正意义上的基因图谱，既分子标记与目的基因之间的距离应该由实际的碱基数来计算。染色体分带图、限制酶切图谱、跨叠克隆群、DNA序列图谱等。初步定位用与目的基因两侧连锁最紧密的分子标记杂交筛选大片段DNA文库中的阳性克隆，找到对应的大片段克隆，然后从两端进行染色体步移，直到获得具有目的基因两侧分子标记的大片段克隆或跨叠群。初步定位用含有目的基因的大片段克隆如BAC或YAC克隆去筛选cDNA文库，并查询生物数据信息库，确定候选基因。然后，(1)cDNA与目的基因是否共分离；(2)cDNA的时空表达

4、与表型是否一致；(3)测定cDNA序列，查询数据库，了解基因的功能；(4)筛选突变体文库，找出DNA序列上的变化及与功能的关系；(5)进行功能互补试验。初步定位功能互补试验（转基因）是最直接、最终鉴定基因的方法。利用RNA干扰（RNAi）也可有效地确定目的基因。Pto基因的初步定位Fig.1RFLPmapofchromosome5oftomatoshowingthelocationofthePtogeneandlinkedmarkers.ThehatchedregionrepresentsthechromosomalsegmentderivedfromL.pimpinellifolium

5、thatispresentintheNILRioGrande-PtoR.Fig.2Thehigh-resolutionlinkagemapofthePtolocus.co-segragatedwithPto1200F2individualsderivedfromacrossbetweenNILs(RioGrande-PtoRandRioGrande)高密度连锁图谱及精细定位物理图谱构建Fig.3GeneticmapofthePtoregiononchromosome5(boldline).RFLPmarkerTG538wasusedtoscreenatomatoYAClibrary.A4

6、00-kbclone,PTY538-1wasidentifiedthathybridizedtothismarker.PTY538wasusedtoprobeatomatoleafcDNAlibrary.TwoofthecDNAclones,CD127andCD186,cosegregatedwithPto.Fig.4(A)DNAblotanalysisofthePtogenefamilyintomato.(B)DNAblotanalysisofYACPTY538-1.确定候选基因TheCD127clonedetectednumerouspolymorphicfragmentswhenh

7、ybridizedwithblotsofgenomicDNAfromRioGrande-ProRandRioGrandeplants.Doestheclonecontainexonsspanningalargeregionorthatitpresentsafamilyofrelatedgenes?TheYACcontainedalloftheCD127-hybridizingfragments,withtheexceptionofa