酶工程PPT.ppt

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1、热稳定的脂肪酶在固相中伸展/重折叠下的活性恢复与残留半胱氨酸对重折叠效率的影响开放式BTL2的结构摘要从Geobacillusthermocatenulatus(BTL2)中得到的脂肪酶在两种不同的基质中固定。一该脂肪酶在琼脂糖(已经过溴化氰的处理CNBR-BTL2)中，通过其最活泼的氨基固定；二该脂肪酶在乙醛酰基(GX-BTL2)基质上共价固定。第二种固定条件导致了，在酶中赖氨酸最丰富的地方和培养基中乙醛酰基最丰富的地方，出现了多个共价键结合的点。由此产生的固定化产物在高浓度的胍中灭活，继而在液态环境下悬浮。在两种条件下，在伸展/重折叠过程中，残留半胱氨酸的氧化导致了酶的不充分折叠。因为经过

2、3小时的复性，酶只恢复了到之前活性的25~30%。二硫苏糖醇（DTT），一种非常温和的还原剂，可以防止半胱氨酸在伸展/重折叠过程中的氧化。有效地提升了酶在复性形式下的活性回复率。其他变量，如ph值、缓冲物质、高分子材料或者其他添加剂，对两种基质中的复性效率和复性程度有着不同的影响。在第一种情况下（CNBR-BTL2）,酶表面的化学性质对于理想的蛋白质重折叠，十分重要。由此，不带电的蛋白质比带电蛋白质，可以更有效地产生重折叠的效果。简介酶是许多大型工业过程中有效的催化剂，但是酶脆弱的稳定性，大大的影响了它的运用。在固态培养皿上的固定的酶在不同的操作条件下使用（比如中性的ph值，微温，以及惰性的有

3、机溶剂）使用，这些操作导致酶产生不良的构象变化，使自身的活性降低。当酶完全失去活性时，酶可能完全伸展，并且进一步折叠成其初始构象，恢复催化活性。因此，固定化酶的恢复活性，对于大规模将酶投入工业运用是一个重大突破。在此文中，酶的伸展/重折叠被运用于经过多次操作的固定化酶。大多数这方面的试验都以可溶性酶作为实验对象；仅有少数实验以固相酶作为实验对象。近期，若干种已固定的酶被恢复了活性。重折叠的实验是在固相酶在含水条件下完成的。结果是：与固态基质共价结合的酶，比那些只由一些简单化学键固定的酶能更好的重折叠。因此，强力的共价键和也许可以防止完全的伸展，并且保留“些许”三维构象---这“些许残留”的构象

4、也许就是酶重新恢复活力的重要条件。基于脂肪酶有广泛的作用对象，因此脂肪酶经常被选为实验对象。BTL2，是一种热嗜碱酶，最近已结晶BTL2开放式结构，并确定。现在BTL2封闭和开放的形式之间的过渡细节已众所周知。紧密开放的过渡涉及界面活化诱导了巨大的构象变化，这种变化是迄今为止在蛋白质的结构重组方面相当复杂。此外，在三维结构，两个金属结合域（一个钙离子和对Zn2+）已发现活性和稳定性中扮演重要的角色。这种蛋白质需要许多结构域折叠在一个活跃的位置，这意味着成功复性其三级结构是一个更大的挑战。在以往的研究，BTL2稳定性的增加由乙醛酰基-琼脂糖（GX-BTL2）上的共价固定化，而不是固定在溴化氰琼脂

5、糖上（溴化氰BTL2）。因此它依靠更高三维结构上多点共价结合的获得。在这里，我们提出了固相中展开/折叠重新激活BTL2的方法。我们阐明了酶失活的机制，主要依靠蛋白质的氧化状态。折叠/展开的过程，恢复双方最初的活性和相对映的非手性和手性底物。最后，我们研究了影响复性效率的不同变量，如复性添加剂，不溶性衍生物的表面性质和复性pH值。2.材料和方法2.1材料和传统的方法所有材料均为分析纯脂肪酶，DTT，胍，海藻糖，纯化和酶比色法进行描述。2.2在8M胍中BTL2催化剂中孵化准备湿重两克的固定化物在25℃下用10体积8M胍清洗10遍，所需的pH值（0.1M醋酸钠pH值5，0.1M磷酸钠pH=7，0.1

6、M碳酸氢钠pH=9）。在某些情况下，25mMDTT加入到的胍溶液中。然后，固定化酶的悬浮在20毫升相同溶液中。定期的取出50微升的样品并测定活性。同时检验稀释后胍的存在并不影响酶的活性。2.3在水溶液中展开孵化后的BTL2催化剂，将不溶性酶制剂在孵化过的胍溶液中预先展开，用10倍体积水相缓冲溶液（或没有DTT）中清洗10遍，以消除胍，然后悬浮于相同的缓冲液中。定期取出样品并测定活性。在某些情况下，缓冲液中包含了不同的添加剂，如DTT和海藻糖。2.4。短期内再激活率的测定衍生物在8M胍和25mMDTT中孵育展开。酶失活后，通过过滤去除展开溶液，不用洗涤。这些衍生物悬浮在介质上进行活性测定。衍生物

7、的活性在不同时间间隔，（0-25s，25-50s，50-75s，75-100s，100-150s，150-200s，200-300s和300-400s）不同的添加剂的存在或缺乏的情况下测定。得到的最大的活性是在展开时没有加入CNBr-BTL2添加剂。活性值在不同的时间被称为上面定义的最高的活性。活性增长接近于渐近方式，从而经过经验性调整，得到一个二阶方程来计算的最大复苏活性和复性率（达到最大复性5