HPLC测定蛋白质含量方法验证.ppt

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1、精益生产智能管理———HPLC测定蛋白质含量方法确认发言人：程红波日期：2016-3-15方法确认（HPLC法）目的：证明HPLC方法适合于重组人粒细胞刺激因子蛋白质含量检测要求依据：《中国药典》2015年版洗脱梯度（2015年版中国药典）按下表进行梯度洗脱编号时间/分A/%B/%1060402402080345010045060405606040A：0.1%三氟乙酸的水溶液B：0.1%三氟乙酸的乙腈溶液含量计算公式供试品蛋白质含量（ug/ml)=CR×AX×nXAR×nR式中CR为复溶所得标准品溶液的蛋白质含量，ug/ml；AR为标准品溶液的平均峰面积；AX为供

2、试品溶液的平均峰面积；nR为标准品溶液的稀释倍数；nX为供试品溶液的倍数；方法比较（lowry与HPLC）Folin-酚（lowry）HPLC要求人为精确控制操作时间设备控制时间，减少人为误差操作复杂，干扰因素较多操作简便，干扰因素较少重复性、精密度较差重复性、精密度较好只适用于检测原液的蛋白质含量适用于原液及成品的蛋白质含量/2015年版《中国药典》首次规定的检测方法方法比较（lowry与HPLC）批序号lowry法（ug/ml)HPLC法(ug/ml)原液批114771417原液批213931358原液批314321379原液批414661413原液批5138

3、91327原液批614561415原液批713951352原液批814281386结论：lowry法与HPLC法所测得的浓度存在一定的差异！色谱图比较工作标准品色谱图例供试品色谱图例25.75725.688重复性实验（出峰时间）批序号类别规格（ug/ml）平均峰出峰时间RSD值(%)/标准品7525.5460.057/标准品15025.5370.038/标准品30025.5350.023原液批1供试品30025.5410.050成品批1供试品7525.5440.048成品批2供试品15025.5060.033成品批3供试品30025.5940.040实验结论：RS

4、D值﹤1%，符合2015年版《中国药典》要求重复性实验（峰面积）实验结论：RSD值﹤1%，符合2015年版《中国药典》要求批序号类别规格平均峰面积RSD值/标准品75ug/ml4406.240.08%/标准品150ug/ml4610.700.13%/标准品300ug/ml4722.040.53%原液批1供试品300ug/ml4749.360.52%成品批1供试品75ug/ml4559.720.58%成品批2供试品150ug/ml5063.890.23%成品批3供试品300ug/ml5372.140.40%精密度实验（出峰时间）批序号类别规格（ug/ml)平均峰面积

5、RSD值（%）分析员A分析员B分析员A分析员B/标准品7525.51125.5340.0320.056/标准品15025.53725.5670.0770.061/标准品30025.56125.5810.0620.033原液批2供试品30025.55425.5440.0350.047成品批4供试品30025.53825.5360.0350.048成品批5供试品15025.57925.6670.0640.073成品批6供试品7525.56425.8180.0590.043实验结论：RSD值﹤2%，符合2015年版《中国药典》要求精密度实验（峰面积）批序号类别规格（ug

6、/ml)平均峰面积RSD值（%）分析员A分析员B分析员A分析员B/标准品753660.263677.381.301.11/标准品1503715.153722.891.270.97/标准品3003478.193500.130.931.59原液批2供试品3003424.813434.331.841.06成品批4供试品3004513.684538.381.280.99成品批5供试品1504273.844333.331.261.01成品批6供试品753832.753839.971.101.66实验结论：RSD值﹤2%，符合2015年版《中国药典》要求1、通过对峰面积及出峰

7、时间的计算对比，重复性实验RSD值均低于1%，精密度实验RSD值均低于2%，说明使用以上方法对赛格力成品及原液进行蛋白质含量测定的数据结果具备重复性、精密度2、符合2015年版高效液相色谱法验证要求3、通过对大量赛格力原液和成品的检测，说明该方法适用于我公司产品的检测，且该方法具有一定的稳定性及可靠性实验结论