基因工程步骤.ppt

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1、§1.2基因工程的基本操作程序质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种4、构建过程：基因表达载体复习:基因工程的基本操作步骤提取目的基因目的基因与运载体结合将目的基因导入受体细胞目的基因的表达和检测基因工程的基本操作程序主要包括五个步骤：1）获取目的基因2）制备重组DNA分子3）转化受体细胞4）筛选重组细胞5）实现功能表达一、目的基因的获取:主要指的是编码蛋白质的结构基因2、目前常用获取方法：1、目的基因：1)、从基因文库中获取2)、利用PCR技术扩增3)、利用人工

2、合成方法从基因文库中获取：目的基因①、基因文库:将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。基因文库的构建模式图通过对受体菌的培养而储存大量目的基因②基因文库:基因组文库部分基因文库（cDNA文库）③如何从基因文库中得到所需要的基因依据：目的基因的有关信息如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性利用PCR技术扩增：目的基因１）ＰＣＲ技术的原理：２）获取的前提：DNA双链复制３）PCR技术过程：要有一段已

3、知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物变性、复性、延伸，结果:数量呈２n扩增．5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G变性复性延伸1.目的基因DNA受热变性，解链；2.引物与单链互补结合；3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ利用PCR技术扩增目的基因利用PCR技术扩增目的基因反转录法根据已知的氨基酸序列合成人工合成：目的基因１）使用范围：基因较小，核苷酸序列又已知，可以人工合成２）具体方法：二、（25）基因表达载体的构建：核心1、表达载体的组成：复制原点+启动子+目的

4、基因+终止子+标记基因等2、表达载体的功能：1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并能遗传2）使目的基因能够表达和发挥作用位于基因首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质启动子：终止子：位于基因的尾端，能终止DNA的转录为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来标记基因：质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种4、构建过程：基因表达载体三、将目的基因导入受体细胞：1、转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体

5、细胞内维持稳定和表达的过程2、常见的几种转化方法：导入植物细胞：导入动物细胞：导入微生物细胞：农杆菌转化法（最常用）显微注射技术（最常用、最有效）利用感受态细胞与重组质粒混合基因枪法花粉管通道法1）、目的基因导入植物细胞：（1）农杆菌：农杆菌转化法易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物无感染力，植物受伤时伤口处分泌大量的酚类化合物，会吸引农杆菌。（2）转化程序：目的基因Ti质粒上的T－DNA插入植物细胞农杆菌染色体DNA上维持稳定和表达并整合到导入感染同时T-DNA导入２）、目的基因导入动物细胞：（1）转化程序：

6、显微注射技术目的基因表达载体提纯显微注射取卵受精卵新性状的动物导入发育３）、目的基因导入微生物细胞：（1）原核生物特点：繁殖快、多为单细胞，遗传物质相对较少等。应用最广泛的是：大肠杆菌（２）转化程序：Ca2+处理细胞形成将重组表达载体溶于缓冲液感受态细胞混合完成转化(四)目的基因的检测与鉴定检测：①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质利用：DNA分子杂交技术利用：分子杂交技术利用：抗原－抗体杂交鉴定：如：抗虫、抗病特性的鉴定、活性鉴定等利用个体生

7、物学水平(四)目的基因的检测与鉴定1、为了培育节水高产品种，科学家将大麦中与抗旱节水有关的基因导入小麦，得到转基因小麦，其水分利用率提高了20%。这项技术的遗传学原理是A．基因重组B．基因突变C．基因复制D．基因分离A点点生物学教学2、利用苏云金芽孢杆菌的抗虫基因培育的抗虫棉是否成功，最好检测A．是否有抗生素产生B．是否有目的基因表达C．是否有抗虫的性状出现D．是否能分离到目的基因C点点生物学教学3、水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中天冬氨酸、甘氨酸和丝氨酸构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转

8、基因技术中，这种蛋白质的作用是A．促使目的基因导入受体细胞B．促使目的基因在受体细胞内复制C．使目的基因容易被检测出来D．使目的基因容易成功表达C点点生物学教学4、根据mRNA的信息推出获取目的基因的方法是A、用DNA探针测出目的基因B、用mRNA探针测出目的基因C、用mRNA反转录形成目的基因D、用PCR技术扩增m